流式分析的样品制备需要注意这六点[心得点评]

【字体: 时间:2019年02月20日 来源:生物通

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  近年来,随着检测参数越来越多,流式细胞仪也日渐普及。不过,尽管多个参数同时分析可带来大量信息,但在样品制备过程中必须采取适当的措施,才能保证流式数据是相关的。如何才能少走弯路,下面听听各位专家的建议。

近年来,随着检测参数越来越多,流式细胞仪也日渐普及。不过,尽管多个参数同时分析可带来大量信息,但在样品制备过程中必须采取适当的措施,才能保证流式数据是相关的。如何才能少走弯路,下面听听各位专家的建议。

1. 从采集那一刻开始

流式分析所用的样品是十分多样化的,从细胞、血液到组织等。这些需要不同的样品采集和处理方法。“血液或组织样品通常在分析前几天、几周甚至几个月采集,比如大型队列研究,”美天旎的全球产品经理Johannes Fleischer解释说,“若保存不当,可能会影响结果。为了实现高度标准化,建议使用专门的组织保存试剂、冷冻干燥或保存在-80℃,以减少实验可变性。”

2. 是否需要富集细胞?

BioLegend的技术服务专家Ekaterina Zvezdova表示:“通常,人们利用抗体或细胞因子等刺激物处理后,使用流式细胞仪来评估细胞的活化状态。然而,对细胞的刺激往往会导致表面受体内化。例如,抗CD3抗体对T细胞的刺激导致T细胞表面的TCR/CD3复合物下调,因此无法通过CD3或TCR分子来鉴定异质群体中的T细胞。”

他认为,研究人员需要预测不同处理方式对特定细胞标志物的影响,从而制定有效的策略来收集数据。比如,在细胞鉴定时采用替代性的谱系标志物,或者在刺激之前就富集感兴趣的细胞亚群。

Fleischer也强调了富集细胞的好处。他解释说,稀有细胞,比如循环肿瘤细胞、造血干细胞和抗原特异性T细胞,在流式实验中是很难捕获的。“使用与抗体偶联的磁珠,可以富集这些稀有细胞,”他说。美天旎的MACSQuant Analyzer流式细胞仪可与磁性富集柱相整合,从而实现自动化的细胞富集。

3. 解离细胞有何影响?

众所周知,流式分析需要单细胞悬液,因此当研究人员分析实体组织的细胞时,首先需要解离样品。机械解离和酶解消化都是常用的方法,但两者都会引起细胞应激,并导致细胞存活率不高。

“为了提高重复性,我们开发出GentleMACS™解离设备,这种自动化的仪器带有预先设好的程序,可以更温和地解离特定的生物材料,”Fleischer解释说。“我们还设计出一系列组织特异性的解离缓冲液,作为GentleMACS设备的补充。我们已经生成了大量的测试数据,证明它们可以更好地保留细胞表面的表位。”

Zvezdova也指出,酶解消化往往会影响抗体结合的表位。“例如,贴壁细胞经过胰蛋白酶处理会导致钙粘蛋白的切割和失活,使得对应的抗体难以识别其靶点。为了减少这些影响,使用更温和的解离溶液是明智之举,如Accutase®。”

无论采用哪种形式的解离,Fleischer都建议使用细胞滤网进行过滤,以去除样品中的团块。“大多数研究人员在流式分析中都遇到过进样管堵塞的痛苦时刻,而细胞滤网是避免堵塞和外溢的关键工具,”他说。

4. 固定也需要优化

固定这个步骤也会影响抗体结合表位。一些抗体用于固定细胞染色时表现出信号损失。“我们对一些抗体克隆进行了内部测试,比较了未固定的细胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的细胞,”Zvezdova说。“这些结果显示了固定表位的染色是否有可能成功,如果您的抗体克隆未提供相关信息,我们通常建议在固定细胞前进行表面染色。”

温度也会明显影响抗体结合,导致趋化因子和细胞因子受体等表面蛋白的快速内化。如果要在固定前对细胞进行染色,那么最好在室温或37℃下进行抗体孵育,而不是4℃。

5. Fc封闭可降低背景

抗体与免疫细胞上的Fc受体结合是造成背景染色的主要原因,会导致假阳性结果,或掩盖低丰度靶点的存在。因此,在开展免疫染色之前,最好加入Fc封闭步骤。“尽管使用Fc封闭试剂可减少背景染色,但这会导致实验操作中多了一步,并可能造成细胞损失,”Fleischer指出。

“为了让Fc封闭不再成为必需,我们开发出了REAfinity™重组抗体。这些抗体的Fc区域经过改造,不再与Fc受体结合,能够产生一致性更好的流式分析数据,”他说。

6. 巧用活细胞染料

Nanna Therapeutics的科学家Catherine Klapholz认为:“在样品制备过程的多个阶段进行细胞计数,以确认未出现明显的细胞损失,这是一种明智的做法。活细胞染料可提供有用的信息,告知不同的制备技术对整个细胞群的影响。不过,必须测试染色的稳定性。数据采集有时需要1-2小时,并且是在室温甚至4℃下,则信号有可能会急剧增加。”

无论我们对样品制备过程采用多么精心的优化,但适用于A细胞的方案不一定适用于B细胞,正所谓“甲之蜜糖,乙之砒霜”。只有为每种细胞量身定制不同的样品制备方案,我们的流式细胞分析才有可能获得成功。(生物通 薄荷)

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