使用新型MagMAX试剂盒在自动化KingFisher平台上进行人类微生物组的宏基因组分析

关键信息

• Applied Biosystems™ MagMAX™微生物组Ultra核酸分离试剂盒可从人体粪便和其他类型样品中分离出高质量、无抑制剂的DNA和RNA
• 核酸的质量适用于宏基因组测序和其他对开发给定样品中基因全面表达谱至关重要的技术
• 将Thermo Scientific™ KingFisher™仪器与MagMAX微生物组试剂盒配合使用可缩短整体处理时间，从而加快工作流程

简介

人类微生物组已经在许多疾病诊断和治疗中发挥了关键作用。正确鉴定构成微生物组的微生物种类及其丰度的计算都是重大挑战，宏基因组测序技术的出现在某种程度上克服了这一挑战，该技术可提供给定样品中所有基因的全面表达谱。

人类微生物组计划（HMP）已经证明，每个人体部位生存着不同显著性的分类群。比较患病和健康受试者所生成的宏基因组数据，会发现许多细菌会引发疾病，或者预防疾病[1]。

肠道含有与人体相关的大量微生物群，并且是人体中被检查最彻底的微生态系统之一[2]。粪便样品易于获得并含有大量微生物，因此常用于宏基因组分析。对唾液和尿液等体液研究较少，但它们都含有独特的细菌群落。

微生物DNA的分离是测定每个人体部位的微生物组图谱的首要前提，但是仍然很难获得足够的DNA量以进行微生物组成分的准确推断并提高样品类型结果的可比性。本指南将展示MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒从粪便、尿液和唾液中分离总核酸的能力。通过宏基因组测序深入研究每种样品的微生物多样性。本研究强调了利用微生物组作为疾病标记物的潜力。

材料和方法

从两个健康供体中采集人体粪便、唾液和尿液样品，并且在采集当天使用MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒进行一式两份的总核酸分离。使用100mg粪便和400L唾液和尿液的起始量。使用配有96个深孔磁头的Thermo Scientific™ KingFisher™ Flex磁珠纯化仪自动分离总核酸。在Thermo Scientific™ NanoDrop™ 2000分光光度计上测量产量。在分光光度计上测量吸光度（A260/A280），随后进行1%琼脂糖凝胶电泳，以评估粪便总核酸的纯度和质量。

接下来，在快速循环条件下使用Applied Biosystems™ TaqMan®检测试剂盒和Applied Biosystems™ TaqMan® Fast Advanced预混液，对每种样品进行一式三份的qPCR分析。每份反应物中核酸的体积占20%。

宏基因组处理

将从粪便、唾液和尿液中分离的总核酸样品送至Zymo Research（Irvine，CA），使用ZymoBIOMICS™ Shotgun Metagenomic Sequencing Service.进行宏基因组测序。

根据供应商的方案，使用KAPA™ HyperPlus试剂盒制备测序文库，DNA起始量为100ng。文库使用内部8 bp barcodes和Illumina™ TruSeq™接头。所有文库均使用Agilent™ TapeStation™系统进行定量，并混合均匀。使用qPCR定量最终混合液并用Illumina™ HiSeq™系统测序。

使用Trimmomatic-0.33过滤原始测序读数以去除低质量片段和接头[3]。使用6bpsliding window和20的quality cutoff 进行数据过滤，从而删去小于70bp的测序数据。使用MetaPhlAn2[4]对微生物组成进行分析，并使用KronaTools绘制图谱[5]。

从MetaPhlAn2输出的数据中提取物种级丰度信息并进行进一步分析：

• 使用QIIME创建微生物组成条形图并进行β多样性分析（基于Bray-Curtis相异度）[6]
• 使用内部Python™脚本创建具有分级群聚（基于Bray-Curtis相异性）的分类丰度热图
• 使用LEfSe[7]在默认设置（p>0.05，LDA效应值>2）条件下发现生物标志物

结果

总核酸—产量、纯度和质量

由于使用了创新的基于磁珠的技术，并预先进行了珠磨，因此使用MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒进行的高通量分离可以更快地处理样品，从而可以使用Thermo Scientific™ KingFisher™ Flex或Duo Prime仪器一次纯化多达96份样品。

对于粪便样品，可以从100mg的样品起始量中获得高产量的总核酸（45-64g；图1）。对于唾液，从400L样品起始量中获得的总核酸产量范围达1.5至2.5g（数据未显示）。对于尿液，从400L样品起始量中获得的总核酸产量范围达0.2至0.3g（数据未显示）。从所有样品类型中分离的所有总核酸的A260/A280比率>1.7，表明制剂纯度较高。粪便总核酸的琼脂糖凝胶分析表明，所回收的微生物DNA和RNA的质量较高（图2）。

图1. 100mg粪便样品中的总核酸产量。使用MagMAX微生物组试剂盒处理来自两个供体的样品。预先的珠磨步骤后，使用配有96个深孔磁头的KingFisher Flex磁珠纯化仪进行分离。A260/A280值显示在柱上。

图2.从粪便中纯化的总微生物核酸的质量。对于每个供体，使用1%琼脂糖凝胶对一式两份的1g总核酸样品进行电泳。可以看到基因组DNA和RNA的清晰条带。使用Invitrogen™ 1 Kb Plus DNA分子量标准品进行尺寸测定。注意，由于这不是变性凝胶，因此RNA的视觉尺寸与实际尺寸不同。

对从粪便、唾液和尿液样品中分离的总核酸进行厚壁菌门、拟杆菌门和大肠杆菌的TaqMan qPCR检测。人体中通常都包含这三种细菌，不过大肠杆菌的丰度通常较低。对这两种菌门和大肠杆菌的检测代表了广泛的细菌。正如所预期的那样，粪便样品含有高水平的厚壁菌门和拟杆菌门（图3A），而尿液和唾液样品含有高水平的厚壁菌门（图3B和C）。所有样品类型中的大肠杆菌丰度较低，但仍在可检测范围内（图3A、B和C）。

使用Applied Biosystems™ Xeno™ DNA和RNA对照品进行的TaqMan检测显示，纯化得到的总核酸没有抑制作用（数据未显示），证明MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒能够分离出高质量、无抑制剂的核酸，即使是从最具挑战性的样品中。

图3. 使用MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒，对从两个供体的（A）粪便、（B）尿液和（C）唾液样品中纯化的DNA进行qPCR分析。使用TaqMan检测试剂盒分析一种革兰氏阳性细菌（厚壁菌门）和两种革兰氏阴性细菌（拟杆菌门和大肠杆菌）。对于厚壁菌门和拟杆菌门的检测，将总核酸样品以1：100的比例稀释，而对于大肠杆菌检测，不稀释原始样本。TaqMan Fast Advanced预混液在快速循环条件下使用。

对从粪便、尿液和唾液中分离的总核酸进行Shotgun宏基因组测序

对来自两个供体的粪便、尿液和唾液样品的总核酸进行分离并测序；图4显示了宏基因组测序数据，即所有粪便、尿液和唾液样品的丰度热图。此处显示的丰度热图并不代表每种样品类型的完整微生物组图谱。物种级的全基因组图谱如图5所示。请注意，除细菌外，MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒还可以分离病毒总核酸（如图4中的尿液和唾液组图谱所示）。粪便和唾液的宏基因组图谱仅将普雷沃菌属物种作为常用的细菌靶标，而尿液和唾液宏基因组图谱具有相同的病毒靶标。供体1（zr2132.1）的粪便核酸的宏基因组测序图谱显示普雷沃菌属、粪杆菌属、罗斯氏菌属、拟杆菌属、别样杆菌属等具有高丰度，而供体2（zr2132.2）的测序结果显示其多种拟杆菌、粪杆菌属、双歧杆菌属、副杆状菌属等具高丰度。使用Centrifuge程序将所有样品绘制到人类数据库中（数据未显示），数据证明MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒可以将细菌靶标的分离率提高到高达99%，并且可以在粪便样品中检测到水平极低（0.06-0.45%）的人体靶标。

图4. 粪便、尿液和唾液样品分离产物的鸟枪法宏基因组测序丰度热图。

物种级的完整宏基因组图谱显示，对不同给定样品，检测图谱中多个细菌和病毒靶标不同。两个供体的粪便样品具有大量的拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门。供体1的粪便样品显示，粪便普雷沃菌、多种拟杆菌属物种、罗斯氏菌属、粪杆菌属、萨特氏菌属和其他物种具有高丰度，而供体2的粪便样品显示，拟杆菌门、双歧杆菌属、粪杆菌属、罗斯氏菌属、萨特氏菌属和其他物种具有高丰度。两个供体的尿液样品中，乳杆菌属、链球菌、拟杆菌属、瘤胃球菌和双歧杆菌属、假单胞菌噬菌体和其他物种具有高丰度。两个供体的唾液样品中，轻型链球菌、其他链球菌物种、颗粒链菌属、奈瑟菌属、普雷沃菌属和其他物种具有高丰度（图5）。

图5. 使用Shotgun宏基因组测序识别粪便、尿液和唾液样品的全宏基因组图谱。每种颜色代表每个样品识别的不同操作分类单元（OTU）。

结论

我们开发了一种使用全新MagMAX微生物组Ultra核酸分离试剂盒，从人体粪便样品和其他样品类型中分离高质量、无抑制剂的DNA和RNA的自动化快速工作流程。对来自两个供体的样品进行全基因组测序，获得粪便、尿液和唾液中微生物的总体图谱。我们开发的工作流程利用微生物组研究的力量，可以快速生成人体内细菌群落的宏基因组数据，这些数据可用作某些疾病的诊断生物标志物，并为未来的微生物组疗法铺平道路。

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