CRISPR文库这么多,如何选择才好?[心得点评]

【字体: 时间:2019年04月26日 来源:生物通

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  幸好,市场上出现了一些设计好的文库,能够拯救水深火热中的你。这些文库避免了耗时的设计和验证工作,且精心挑选的sgRNA有着最佳效率和生物学意义。不过,在选择这样的预设计文库时,你还有一些因素需要考虑。

确认基因型和表型之间的关系是功能基因组学的最终目标。如今,功能基因组学有了一种强大的新工具,那就是CRISPR-Cas9文库。这种方法利用慢病毒载体大规模导入全基因组sgRNA文库,能够同时靶向数千个基因,实现高通量的功能基因筛选。

大家最常用的Cas9靶定5’-NGG PAM位点,这种位点在人类基因组中平均每8 bp就出现一次,因此我们有大量的sgRNA可供选择。不过,如何选择?这才是关键。并非所有sgRNA的效果都相同,每个sgRNA的效率和特异性存在差异。这意味着设计最佳的sgRNA文库并非易事。

幸好,市场上出现了一些设计好的文库,能够拯救水深火热中的你。这些文库避免了耗时的设计和验证工作,且精心挑选的sgRNA有着最佳效率和生物学意义。不过,在选择这样的预设计文库时,你还有一些因素需要考虑。

CRISPR-Cas9工具箱

在开展CRISPR-Cas9筛选时,首先需要选择的是遗传扰动的类型,这主要取决于你想解决的生物学问题。最常见的选择是CRISPR-KO敲除文库,其中Cas9蛋白在DNA上引入双链断裂,通过基于非同源末端连接(NHEJ)的DNA修复来引入移码突变,从而破坏基因功能。这些文库的sgRNA针对组成型表达的外显子,并且通常靶向5’末端。

然而,基因敲除并非适用于所有场景。对许多疾病而言,正是基因表达的调控及相关的表型变化驱动了疾病的发展。因此,上调或下调基因可能更合适,而不是完全敲除基因,特别是在研究非编码区和必需基因,或观察不同表达水平下的表型变化时。

CRISPRi(CRISPR干扰)文库将催化失活的Cas9(dCas9)与转录抑制因子相连接,干扰转录过程,导致基因knockdown。同时,CRISPRa(CRISPR激活)文库将dCas9与转录激活因子(比如VP64或SunTAG)相连接,从而增强基因表达。选择CRISPRa文库意味着你不需要克隆和过表达感兴趣的cDNA,即可实现全基因组范围的功能获得筛选。

每个基因需要多少个sgRNA?

CRISPR文库须针对每个基因设计多个向导RNA,以确保每个目标都得到修饰,且结果具有统计学意义。每个基因的sgRNA数量越多(大约8-10个),可确保统计可靠性更高,有利于在初级筛选中鉴定表型较弱的基因。当然,这也意味着筛选工作量更大,成本更高。

减少每个基因的sgRNA数量(大约3-4个)将降低统计显著性,但会产生较小的文库,从而允许用较少的细胞进行筛选。这也意味着细胞培养的时间和成本比较低。这样的文库适用于数量有限的细胞(如原代细胞),可用于筛选多个模型且合并后开展测序,从而降低测序成本。

尽管早期的CRISPR筛选及相关的文库都是全基因组范围的,比如张锋团队构建的GeCKO文库,但之后也涌现出形形色色的文库,可关注特定的基因家族或生物学通路。例如,赛默飞世尔科技就提供了针对可成药基因组、激酶、GPCR、转录因子等目标的19种文库。

缩小筛选的范围,减少目标的数量,这种操作有不少好处。首先,可增加每个基因的sgRNA数量,以提高统计置信度,并降低测序成本和后续分析的负担。其次,还有望降低系统中的噪声,检测到可能被屏蔽的目标。

Tips:

▪ 一些CRISPR文库在使用前需要扩增,但必须确保文库扩增后的代表性
▪ 借助新一代测序可验证文库完整性,以及扩增后所有sgRNA都存在
▪ 一些文库是以立即可筛选的慢病毒形式提供的

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CRISPR文库的形式

市场上销售的CRISPR-Cas文库是针对一般用途而设计的,而目标的选择是基于基因组数据。由于基因组注释在动态变化,文库中的目标也在不断更新。因此,尽管文库是针对相同物种的,但不同文库的筛选效果可能不同。在使用过程中,你可能需要某些优化。你可以先开展全基因组范围的筛选,然后利用自定义文库开展小规模的研究。

CRISPR文库可以单质粒的形式提供,也可以双质粒的形式提供,区别就在于Cas9的导入方式。在双载体系统中,表达Cas9的质粒先导入,而sgRNA文库后导入。如果Cas9采用了可诱导的启动子,那么在sgRNA文库导入后,细胞可快速表达高水平的Cas9,从而更快实现基因敲除。

原先,由于构建好的重组载体比较大,人们只能将Cas9和sgRNA放在不同的质粒上分别导入,以确保病毒滴度高。不过,如今也出现了单载体系统。好处就是可以少做一次转染,节省时间和经费。

CRISPR-Cas9基因编辑系统的出现,为探索基因型与表型之间的关系提供了一种经济而高效的方法。目前有这么多种预设计的文库,可以帮助科学家跳过令人头疼的设计工作,享用sgRNA设计算法的最新成果。不过,具体如何选择,还是要好好斟酌一番。

(作者:Lucy Thorne博士 / 生物通编译)

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