暨南大学张弓教授：大幅改善毕赤酵母外源蛋白质表达的折叠效率

近日，华南理工大学林影教授和暨南大学张弓教授的团队在Biotechnology for Biofuels杂志（生物工程类一区）上发表文章，使用翻译全局控制方法，改善外源蛋白质在毕赤酵母中表达的折叠效率，有效提高活性蛋白质产量。

　　

生物通报道：暨南大学张弓教授和华南理工大学林影教授在Biotechnology for Biofuels杂志（生物工程类一区）上发表文章，使用翻译全局控制方法，改善外源蛋白质在毕赤酵母中表达的折叠效率，有效提高活性蛋白质产量。据悉，这是翻译组调控在真核生物细胞工厂底盘细胞中的首次成功应用，极大地拓展了合成生物学的施展空间。

人们常使用细胞工厂来表达外源蛋白质，以大量生产具有药用或工业价值的蛋白质。毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的细胞工厂底盘细胞，十分安全且易于低成本培养。但表达出的外源蛋白质常常活性很低，这是由于蛋白质没有正确折叠造成的。事实上，绝大部分外源蛋白质在低等生物工程化表达体系中（包括细菌、酵母）都难以正确折叠，易形成包涵体或者被降解，难以得到可溶性、活性强的蛋白质。这使得许多高价值的蛋白质无法低成本生产。传统的密码子优化、分子伴侣共表达、发酵条件优化等方式作用有限，甚至会起到反效果。

2009年，张弓等人根据大肠杆菌中的研究结果，首先建立了翻译暂停理论“pause-to-fold”，指出核糖体在mRNA上翻译时并不是匀速运动的，密码子的非随机性选择造成了在特定区段上的翻译暂停现象。翻译暂停位点与结构域相对应，如果翻译暂停不正确，即使氨基酸序列正确，环境也适宜，蛋白质也不能正确折叠。

（Zhang et al., Nature Structural and Molecular Biology 2009）这意味着，蛋白质的天然构象不仅与其氨基酸序列有关，也与其合成的过程有关，这对获得1972年诺贝尔化学奖的“安芬森原则”做出了颠覆式的更新。在此理论的指导下，张弓教授等人成功地通过对外源蛋白质编码基因进行序列理性重设计，通过沉默突变修改翻译暂停位点，在不改变蛋白质氨基酸序列、不改变发酵表达条件的前提下，在大肠杆菌中成功使得CVN蛋白质正确折叠，可溶性产量飙升2000多倍，实测抗病毒比活性甚至高于野生型蛋白质，为蛋白质工程提供了一条另类但极为高效的生产优化路线（Chen et al., Journal of Biotechnology, 2014）。

但在酵母中这种策略难以实施，主要原因是酵母的tRNA组未曾测定过，无法对外源基因进行序列理性重设计以优化翻译暂停。于是，华南理工大学林影教授和暨南大学张弓教授的团队直接拿核糖体开刀。核糖体是细胞中最精密的大分子机器，由3个rRNA和几十个蛋白质组成，进化上高度保守，但这并不意味着这台精密机器就不能“卸掉几个零件”。通过对几十个核糖体蛋白进行逐一敲除，课题组发现毕赤酵母中至少有27个核糖体蛋白不是维持翻译功能所必须的，而敲除这些核糖体蛋白的结果，绝大部分竟然可以使外源蛋白的表达活性成倍升高。这些“缺零件”的核糖体很显然会改变细胞内所有的翻译状况，因此这种调控是翻译组级别的调控。

为了揭示其分子机制，课题组对其中几种能显著提高外源蛋白表达活性的核糖体蛋白敲除菌株和不能提高外源蛋白表达活性的敲除株进行了翻译的全局对比。通过对各菌株的翻译组测序（RNC-seq，由承启生物提供翻译组测序服务），课题组确认所有菌株内外源基因的转录几乎完全一致，翻译起始的效率也几乎完全一致。

通过对核糖体组分的分析发现，“有利”的核糖体蛋白敲除株使得核糖体的翻译延伸速率明显减慢，而“不利”的敲除株则没有这种效应。对新生肽链（即在核糖体上尚未合成完毕的蛋白质肽链）进行结构分析表明，“有利”的敲除株中的新生肽链折叠状态更好，更能耐受蛋白酶的攻击。作为结果，“有利”敲除株中的外源蛋白质较少进入不溶性的蛋白聚集体内。这表明“缺零件”的核糖体跑得更慢，有更多的翻译暂停，使外源蛋白能更好的折叠。不仅如此，似乎这种“缺零件”的核糖体也对内源蛋白质的折叠有好处，反映在发酵中前期敲除株的生长更快，能达到更高的菌体密度。

这一研究成果，首次在真核生物中以实验方式确证了翻译暂停理论，并通过改造核糖体的方式建立了毕赤酵母的优化表达菌株，可望较为通用化的解决外源蛋白质的高效活性表达问题，不但可以解决单一蛋白质的生产问题，更可望方便地使转入的多种外源蛋白质（如合成某种代谢产物的整个代谢酶系）都能发挥良好的功能，从而给合成生物学提供适应性更强大的工程平台。

作者简介：

暨南大学翻译组学实验室的负责人张弓教授，翻译组学领域的建立者，其成果被选入国家统编教材。目前，张弓教授是中国生化与分子生物学学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO)理事，中国分子系统生物学专业委员会委员，国家优秀青年基金获得者，国家863青年科学家，国家****“青年拔尖人才”，深圳市龙华区第一届政协常委。
 
原文检索：
Liao X, Zhao J, Liang S, Jin J, Li C, Xiao R, Li L, Guo M, Zhang G *, Lin Y *.
Enhancing co-translational folding of heterologous protein by deleting non-essential ribosomal proteins in Pichia pastoris
Biotechnology and Biofuels (2019) 12:38.