Transomic基因编辑脱靶终结者让您的敲除实验越来越精准

基因编辑是对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精准地定位到基因组的某一位点上，在该位点剪切靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了原有的基因组，真正做到了“编辑基因”。基因编辑技术被发现之初便开启了“DNA干扰”的黄金时代，从简单的病原菌基因的研究，到选育高产粮食作物，再到人类疑难疾病等研究领域都在运用基因编辑技术对生物基因组进行改造。常用的基因编辑技术包括ZFN、TALENS 和CRISPR/Cas9三种系统，而CRISPR/Cas9系统以其简单、高效和低成本等特点，在短时间内被广泛地应用于各个物种中，并迅速在生命科学研究的各个领域发挥着重要作用。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9是天然存在的核酸酶技术，2015年被《Science》评为年度十大科技突破之首。此系统的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，即具有引导并识别靶基因序列作用的sgRNA（single-guide RNA ），sgRNA引导核酸酶Cas9蛋白切割配对的靶位点双链DNA序列。通过人工设计上述两种RNA即可以改造具有引导作用的sgRNA，从而引导Cas9核酸酶对特定位点的切割。

与ZFN/TALEN等同类技术相比，CRISPR/Cas9更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变，所以一直是生命科学研究领域的焦点。随着近几年的发展，研究人员开发出多种基于CRISPR的新型基因编辑技术，使该技术更加广泛、快捷和高效地应用于斑马鱼、植物、小鼠、细菌以及人类细胞等领域的基因修饰，成为科研人员强大的分子生物学工具。

图1. CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

为了更加精准地打靶目标基因，除了对gRNA进行改造，科学家们还发现了Cas9野生核酸酶的变体酶¬Cas9（D10A），Cas9（D10A）会导致单链切口的形成，两个十分接近的位点允许在互补双链上均形成单链切口，进而在基因组上引入类似于靶向性的突变。Nature文献报道，成对的gRNA和 Cas9（D10A）敲除系统可以提高基因敲除效率（Nature Protocols, 2281–2308, 2013），该系统是借助于Cas9（D10A）突变体来加强基因组编辑的特异性，从而降低脱靶效应。

图2. Dual gRNA和 Cas9（D10A）敲除系统。该系统由一对gRNA和Cas9（D10A）变体酶组成，Cas9（D10A）跟随gRNA切开DNA双链中的一条链从而产生缺口。

作为专业的基因功能研究产品的拓荒者，为了方便科学家们对人、大小鼠基因组上的基因进行编辑，美国transOMIC公司与张峰实验室等权威机构合作，开发出一系列成熟的商品化CRISPR/Cas9产品—transEDIT™ CRISPR/Cas9试剂，服务于生命科学研究领域。已经构建好的用于人、大小鼠的基因编辑载体，或慢病毒包装好的成品，即买即用；多种荧光和抗性标记可选，满足多样筛选需求；更加值得关注的是，为了满足客户高通量筛选的需求，transOMIC还提供多种信号通路或重要途径，乃至全基因组的成品文库产品供您选择。

一、 优化的gRNA设计，多样的载体选择，高效的基因编辑

TransEDIT™ CRISPR/Cas9试剂为客户提供了强大的基因组编辑工具，优化设计的Croatan结构的gRNA可克隆到多种表达载体上供客户自由选择，多样的产品形式可以极大满足客户进行特定基因敲除研究工作的需求，成品的试剂让您的基因编辑实验简便易行。

图3. 用transEDIT CRISPR Cas9进行基因编辑，简便易行

TransEDIT™ CRISPR/Cas9试剂依托于慢病毒表达载体，载体上设计有定向敲除靶基因的gRNA和核酸酶，提供多种产品形式：

1. All-in-one产品系列：gRNA和Cas9设计在一个载体上，单载体转染，产品有敲除载体和敲除慢病毒两种类型，试剂盒中含有针对同一个靶基因的3条高效的all-in-one敲除载体和一个阴性对照载体，各种筛选marker及荧光报告基团方便进行筛选。

图4. All-in-one敲除载体结构示意图

2. 双载体系列：单个gRNA设计在一个表达载体上，Cas9核酸酶或者切口酶设计在另外一个表达载体上，双载体共转染进行敲除研究。单独的gRNA表达载体试剂盒、Cas9核酸酶表达载体试剂盒、Cas9(D10A) 切口酶表达载体试剂盒为您提供多种选择。Cas9核酸酶、切口酶表达载体上带有可进行两重或者三重筛选，诱导型敲除产品满足可控性编辑需求，方便进行高效筛选。

图5. 单独表达gRNA和核酸酶的敲除载体结构示意图

3. Dual gRNA系列：两个gRNA设计在一个表达载体上，Cas9核酸酶设计在另外一个表达载体上，双载体共转染进行敲除研究，可将目的基因片段切割下来，从而进一步提高基因敲除效率，您也可以根据自身需求，同时完成两个目标基因的敲除。

图6. Dual gRNA原理示意图和载体结构示意图

二、 CRISPR/Cas9文库产品——可按需定制

为了方便进行高通量功能基因筛选，TransOMIC特别制定了人和大小鼠的多种信号通路或重要途径的文库产品，以及人和小鼠的全基因组文库产品，产品分为质粒形式的混合文库（Pooled library）和储存在96孔板中的甘油菌形式单基因单孔的文库（Arrayed library）。混合文库可有效简化实验流程，缩短筛选周期，Dual-gRNA载体上的BARCODE也便于后期进行测序，单基因单孔的文库方便控制筛选进程，可根据实验目的实时开展和结束实验过程。

▪ 每个文库约包含500个基因。
▪ 单个或两个 gRNA敲除载体文库供客户选择。
▪ 可对基因家族、信号通路或者基因组进行敲除文库的定制。

图7. 混合文库筛选示意图

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