数字PCR原理及应用——Gene-π课堂之一

【字体: 时间:2019年05月09日 来源:深蓝云生物

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  Gene-π学堂开课了,今天先跟大家介绍下数字PCR的原理及应用,在接下来我们将分期进行数字PCR的引物探针设计,实验如何设计,数据如何分析,结果如何判读等系列内容,还请随时关注!

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数字PCR发展

数字PCR(digital PCR, dPCR)是近年来发展起来的一种突破性的定量分析技术。1990年耶鲁大学医学院的Claibome Stephens等应用单分子稀释( single molecular dilution ,SMD ) PCR和泊松统计的方法研究单倍体DNA 。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这就是数字PCR的雏形。

1999年Vogelstein等在检测粪便中进行癌变组织游离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而遇到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。

数字PCR原理

标准PCR反应体系经过微滴发生后,分配到约~30000个微滴中,每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),实现”单分子模板PCR扩增”,扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号,最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外,由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。

数字PCR应用领域

◆ 医学、药学方向:肿瘤研究;传染性疾病研究(细菌、真菌、病毒、支原体);NIPT ;器官移植监控;干细胞研究、移植监控;药物基因组学开发;生物标志物开发;药物生产质控等。
◆ 食品安全:致病微生物、食品过敏原、痕量检测和 GMO转基因等检测。
◆ 环境监控、宏基因组研究。

参考文献
1、Digital  PCR,BERT  VOGELSTEIN,Proc.Nati.Acad.Sci.USA,Vol,96.pp.9236-9241,August 1999 Genetics.
2、Real-time PCR,Saunders NA, Methods Mol Biol. 2004;266:191-211.

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