比CRISPR更高效，精确的新技术！Nature vs.Science两大巨头同时get到新技能

　　

生物通报道：CRISPR技术红得发紫，也备受诟病，其中的两大问题在于脱靶效应和效率低。近期两大顶级杂志，Science和Nature分别公布了Broad研究所张锋研究组和哥伦比亚大学Sam Sternberg研究组（刚从加州大学伯克利分校Jennifer Doudna实验室转入哥伦比亚大学）两项相似的研究成果：利用细菌跳跃基因，将DNA序列精确地插入基因组而不切割DNA。

这两项研究克服了CRISPR技术的主要缺点，为基因工程和基因治疗提供了一种强有力的新选择。

“跳跃基因”又叫转座子，它们无处不在，每个生命领域都携带这些DNA序列，它们利用转座酶从一个位置“跳”到另一个位置，事实上，有接近一半的人类基因组是由跳跃基因组成的。

张锋研究组从蓝藻中抽提了一种转座酶，他们将其命名为CAST，即CRISPR相关转座酶（CRISPR-associated transposase）。Sternberg研究组的新技术则称为INTEGRATE（Insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting），利用跳跃基因将DNA序列插入基因组而不切割DNA。

“目前的工具就像分子剪刀，切割DNA，但实际编辑是由细胞自身的DNA修复机器完成的，”Sternberg博士说。 “你是受到细胞的支配，来完成这项工作的。”

而新技术更像分子胶而不是分子剪刀。

“不用引入DNA断裂，依赖细胞来修复断裂，INTEGRATE可以直接在基因组的精确位置上插入用户定义的DNA序列，这是分子生物学家几十年来一直寻求的能力。”

现有的CRISPR工具太挑剔

利用目前的编辑工具来修改细胞的基因组，就像是使用文字处理器编辑一个巨大的文档，而且这个软件还有自己的想法。

通常，研究人员希望在一个特定的DNA碱基序列上做一个小的改变，基因组的其余部分保持不变。目前最好的工具：CRISPR-Cas系统可以在特定序列切割DNA分子的两条链，就像是在一段文本中添加段落。

这些断裂其实只是开头，实际的“编辑”是由细胞自身的DNA修复机制完成的，然后用研究人员提供的DNA序列来填补空白。

依靠细胞的修复机械有很大的局限性。许多细胞无法正确地修复DNA断裂或在这个过程中引入错误，此外，DNA断裂还会引发DNA损伤反应，产生其它不良影响。

因此，这使得某些细胞类型中的基因编辑变得困难或不可能，严重限制了研究人员安全的引入精确遗传修饰。

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CAST系统

张锋的CAST系统将Cas9切刻酶（D10A）偶联到单链DNA转座酶TnpA上，然后在大肠杆菌基因组中检测到了这种蛋白复合物能够促进外源DNA的定点整合，这说明利用转座子可以实现基因敲入，不过单链DNA模板的制备和体内递送还存在问题。

研究人员分别测试了不同CAST基因和不同长度的tracrRNA对CAST系统的活性的影响。结果发现4种CAST基因对于外源基因整合是必需的，同时216 bp的tracrRNA足以产生外源基因的整合，并且他们还证实这种基因整合只发生一次，从而避免了多次基因插入。

CAST基因敲入系统不是简单的修修补补，而是从头开始设计，并从大自然进化的生物中寻求完整的解决方案，从而突破了原有系统的瓶颈，实现了基因敲入效率的跨越式提升。

INTEGRATE系统

INTEGRATE系统则来自霍乱弧菌。

Sternberg等人为了找到新的基因编辑工具，搜寻细菌，找到了一个独立的DNA编辑系统，这一系统具有不寻常的特性，不需要依靠细胞的帮助。

他们发现将转座子整合到细菌基因组中的特定位点，利用单独的酶将转座子送入基因组，而不是将DNA切割成两个，即酶（整合酶）插入DNA的位点完全由其CRISPR系统控制。

研究人员利用这一发现创建了一种基因编辑工具，将任何DNA序列插入细菌基因组的任何位点。与CRISPR一样，整合酶通过导向RNA找到合适的位点，精确控制供体DNA整合的位置。再通过用其它DNA有效载体替换转座子序列，将长达10,000个碱基的序列插入细菌基因组中。因此，与其它基于整合的编辑工具不同，INTEGRATE技术是迄今为止研究的第一个完全可编程的插入系统。

研究人员在编辑过的细菌进行测序证实，INTEGRATE实现了精确插入，在非目标位置没有额外的拷贝。

改进基因编辑

这项技术能够带来广泛的新基因编辑机会。许多生物技术产品，包括基因治疗和细胞疗法，工程化作物和生物制剂，都需要精确整合。

INTEGRATE技术也提供了一种全新的方法，既有与CRISPR-Cas9相同的可编程性和易用性，又没有与DNA断裂相关的副作用。

“我们可以对这种CRISPR转座子系统进行编程，将其整合到几乎任何基因组位点，之后再通过深入了解其工作原理，我们将能够设计更有效的系统，”Sternberg说。

下一步，Sternberg的团队将检测其他细胞类型，包括哺乳动物细胞。Sternberg说，我们有充分的理由相信精确的DNA整合在哺乳动物细胞中能起到和大肠杆菌中一样的作用，为基础研究和最终的临床应用打开了新的大门。

（生物通：万纹）

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原文标题：

Transposon-encoded CRISPR-Cas systems direct RNA-guided DNA integration,