外泌体如何成为协助肿瘤免疫逃逸的帮凶

【字体: 时间:2019年06月25日 来源:吉凯基因

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  外泌体是否可能携带PD-L1分泌至胞外,协助肿瘤进行免疫逃逸,而且还能不受PD-L1抗体的追杀呢?下面,我们来看一下一篇4月初在CELL上发表的文章,看看外泌体是如果成为肿瘤的帮凶的。

  

免疫逃逸是肿瘤细胞逃生的一个非常重要的机制,PD-L1和PD-1结合就是其中一个重要路径,因此靶向PD-L1\PD-1的抗体药成为热门的解除免疫抑制,治疗肿瘤的药物。但是在前列腺癌中,PD-L1的表达量很低,所以通常对PD-L1抗体不响应。那么为什么前列腺癌细胞上PD-L1的表达量偏低呢,除了细胞内的PD-L1之外,胞外的PD-L1是否也可以行使免疫抑制的作用。也有报道发现PD-L1可在胞外囊泡表达,并且参与免疫抑制。在胞外囊泡中,有一大类引起广泛关注的囊泡,便是外泌体。近几年针对外泌体在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤微环境、肿瘤生长与侵袭等各种生物过程中的研究层出不穷。那么,外泌体是否可能携带PD-L1分泌至胞外,协助肿瘤进行免疫逃逸,而且还能不受PD-L1抗体的追杀呢?下面,我们来看一下一篇4月初在CELL上发表的文章,看看外泌体是如果成为肿瘤的帮凶的。

首先,作者要分析,为什么前列腺癌细胞上的PD-L1的表达量较其他肿瘤低,是转录前还是转录后因素,或者翻译前、翻译后机制导致的这个现象?作者对前列腺癌细胞PC3,DU145, LNCaP上的PD-L1的mRNA和蛋白水平进行了分析,并与黑色素瘤细胞SK-MEL-28进行比较,发现在PC3,DU145上PD-L1的mRNA水平比SK-MEL-28高了近15倍,但是蛋白水平在三株细胞中类似,在LNCaP上PD-L1无论是mRNA还是蛋白均几乎不表达。但是分析PC3和SK-MEL-28细胞中PD-L1的翻译速率以及降解并无显著影响。那PD-L1是否有可能通过胞外囊泡将胞内蛋白释放到了胞外呢,果然,通过密度梯度离心分离得到细胞培液上清中的囊泡,发现PC3细胞上清囊泡中的PD-L1是SK-MEL-28的2-3倍高,说明PC-3细胞中多翻译的那部分PD-L1的确是被包裹进囊泡中释放到了胞外,并且该类囊泡主要是外泌体(Fig. 1)。


Fig. 1

紧接着,作者运用CRISPR-CAS9方法分别敲除了PC3细胞上的Rab27a和nSMase2(控制外泌体合成分泌的关键蛋白),发现PC3分泌的外泌体显著减少,同时胞外囊泡中的PD-L1的蛋白量也显著减少。并且,缺失 PD-L1的Raji B细胞与Jurkat T细胞共培养时,IL-2可以大量分泌,表明T细胞被激活。而当引入PC3的外泌体,可重新抑制IL-2的分泌,说明PC3外泌体可代替Raji的PD-L1表达来抑制T细胞活性(Fig.2)。


Fig. 2

为了回答外泌体中的PD-L1在体内是不是也能起到促进肿瘤的作用这一猜测,作者进一步运用TRAMP-C2模型来验证外泌体中的PD-L1在体内的功能。在TRANP-C2细胞上敲除PD-L1或者Rab27a均不影响体外细胞的增殖,将WT、Rab27a null、nSMase2 null以及PD-L1 null TRAM-C2细胞注射到C57BL6/J小鼠皮下后,WT TRAM-C2造模小鼠肿瘤快速增大,在40-71天就必须进行安乐死,而另三株基因编辑细胞造模小鼠则没有看到明显的肿瘤增长,而且大部分小鼠存活至90天以后。但是将这四株细胞移植入免疫缺陷NSG小鼠,结果与C57BL6/J小鼠中完全不同,肿瘤的生长速率以及小鼠的存活期并无显著差异。以上结果说明Rab27a、nSMase2以及PD-L1是通过抑制了免疫系统而促进肿瘤的生长(Fig.3)。


Fig. 3

对WT TRAMP-C2以及Rab27a null、 PD-L1 null TRAMP-C2细胞造模的小鼠进行观察,发现在14天时,基因编辑细胞造模的小鼠脾脏显著大于WT TRAMP-C2造模小鼠,但是脾脏内的CD8+,CD4+ T细胞以及Treg的比例在各组间是类似的。肿瘤引流淋巴结(tumor-draining lymph node,TDLN)是肿瘤细胞沿淋巴管所能到达的淋巴结,是肿瘤免疫发生的部位,在这个区域,作者发现基因编辑细胞造模小鼠的引流淋巴结区域内,CD8阳性细胞占据了T细胞的绝大部分,而CD4阳性细胞比例显著下降,FoxP3+ T reg的变动幅度不大。通过对CD8+, CD4+T细胞进一步用T细胞疲劳以及激活的marker进行分群,结果表明Rab27a null、 Pd-l1 null TRAMP-C2细胞造模小鼠的T淋巴细胞被显著激活。既然肿瘤细胞是通过外泌体中的PD-L1抑制T细胞的激活,作者又提出一个假设,在外泌体缺失PD-L1的时候,免疫健全的小鼠应该不仅能够直接抑制这些基因编辑过的肿瘤细胞,也应该能够对肿瘤细胞产生记忆。为了验证这一假设,作者对C57BL6/J小鼠皮下注射Rab27a null或者 PD-L1 null TRAMP-C2细胞,90天后,对该小鼠再次注射WT TRAMP-C2细胞,有趣的是,这些小鼠上的肿瘤细胞的确没有长起来。因此,说明T细胞一旦在没有外泌体PD-L1的时候接触肿瘤抗原,他们对外泌体内PD-L1的抑制作用产生抗性(Fig. 4)。


Fig. 4

除了在TRAMP-C2模型上分析外泌体PD-L1的作用,作者还运用了另一个模型——MC38——一种结肠癌模型进行验证。MC38模型与TRAMP-C2稍有不同,该模型能够对PD-L1单抗产生部分响应。经过验证发现,Rab27a null 以及PD-L1 null细胞同样能够抑制小鼠肿瘤生长,延长造模小鼠的生存期,但是PD-L1 缺失对造模小鼠的生存期延长显著优于Rab27a缺失。说明外泌体中的PD-L1在MC38模型中仅起到部分作用,还有部分PD-L1是以外泌体非依赖的模式形式免疫抑制作用。为了验证这一结论,作用对Rab27a null细胞皮下注射小鼠,同时给予PD-L1单抗,该小鼠的存活期与PD-L1 null细胞造模小鼠无差异,这一结果说明,在MC38模型上,虽然外泌体中的PD-L1可抵抗PD-L1抗体,但是仍有部分比如膜上部分PD-L1对PD-L1抗体敏感(Fig.5)。


Fig. 5

外泌体能够由细胞分泌,进入血液和淋巴系统,可以影响远处的肿瘤细胞。那同时注射WT、Rab27a null、PD-L1 null TRAMP-C2到小鼠皮下,又会产生什么样的结果?作者在小鼠身体一侧注射WT TRAMP-C2,在另一侧注射Rab27a null或PD-L1 null TRAMP-C2细胞,结果发现与Rab27a null或PD-L1 null TRAMP-C2细胞共同注射的小鼠,WT TRAMP-C2细胞注射侧形成的肿瘤显著小于单独注射WT TRAMP-C2的小鼠肿瘤,且生存期更长。但是WT TRAMP-C2细胞对另一侧的PD-L1 null TRAMP-C2却有一定的促进肿瘤生成的作用,虽然作用比较弱,这是一个有趣的问题,这个作用的原因目前还不明确,值得探讨(Fig.6)。


Fig. 6

通过以上实验,已基本明确通过敲除Rab27a抑制外泌体分泌,或者敲除PD-L1都可以直接或者在远端解除免疫抑制,抑制肿瘤的生长。最后,作者又在小鼠皮下注射Rab27a null细胞的同时,通过尾静脉注射WT细胞或者PD-L1 null细胞来源的外泌体,发现不论是TRAMP-C2细胞模型还是MC38细胞模型,尾静脉注射WT细胞来源的外泌体,均可以抑制T细胞的激活,促进肿瘤的生长,缩短造模小鼠的存活期。

至此,一个有趣的故事讲完了,外泌体中的PD-L1可协助肿瘤细胞进行免疫逃逸,外泌体在肿瘤的发生发展过程中又罪加一等。其实在去年10月份,Nature上就有篇文献讲述了黑色素瘤细胞分泌的外泌体上携带PD-L1,可抑制CD8阳性T细胞的功能,促进肿瘤的生长。说明外泌体中PD-L1在肿瘤诊断、治疗、指导中有非常重要的作用。同时关于外泌体,我们相信还有许多有趣的故事等着研究学者们去研究发现。

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参考文献:

Poggio et al. (2019) Suppression of Exosomal PD-L1 Induces Systemic Anti-tumor Immunity and Memory. Cell  177, 414–427

Chen, G., et al. (2018). Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-L1 response. Nature 560:382-386.

 

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