如何避开各种大坑，收获完美的IHC结果

早在20世纪30年代，免疫组织化学（IHC）的原理就已为人所知。不过直到1942年，第一项IHC研究成果才正式发表。哈佛大学医学院的Albert Coons等人利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。这被誉为免疫荧光技术的里程碑。

自那时起，组织固定和切片方法、抗原/表位修复、抗体偶联、免疫染色方法及显微镜本身都有了重大改进，可帮助你获得完美的IHC图像。然而，尽管IHC早已普遍使用，但这并不意味着你可以掉以轻心。

困难重重

据Abcam成像和免疫组化负责人Will Howat介绍，主要问题在于研究人员的经验不足。“对于那些实验新手或者刚刚接触IHC的人来说，从零开始设计最佳方案可能很困难。他们会觉得troubleshooting很有挑战性。为了解决这个问题，Abcam建立了一系列IHC操作指南，有望缓解这个问题，”Howat说。

Howat补充说，对于颇有经验的研究人员来说，主要的障碍在于找到适合特定应用的抗体并在实验室中验证它。对此，Cell Signaling Technology（CST）的免疫组化总监Katie Crosby表示认同。

“对于特定的目标，通常市场上有多种抗体可供选择，不过并非每种抗体都可以在IHC中有着完美的表现，”Crosby谈道。“让问题更为复杂的是，大多数抗体在IHC分析中都会产生一些染色。问题是，‘这种染色是否特异？’”

为了获得良好的结果，你必须了解抗体的性能特征。Crosby建议大家评估抗体供应商提供的数据，利用不同类型的组织，采用各种阴性和阳性对照。“通常是开展一系列验证分析，综合起来才能说明抗体染色是特异性的，”她指出。“单一的分析不足以确保特异性。”

Crosby还提醒说，验证数据只是第一步，还远远不够。她认为如果处理不当，完美的抗体也会产生悲催的结果。如果实验室的方案与供应商建议的方案不同，Crosby建议你采用自己的验证分析。

检测系统

完美的IHC离不开特异性的一抗，不过，目前也有多种检测系统可供选择。每种系统都有着不同的灵敏度。

“与信号放大系统相比，直接偶联的二抗有着最低的灵敏度，即使是偶联荧光基团，”Howat解释说。“酪胺信号放大（TSA）系统的扩增带来了最高的灵敏度。关于检测分子，碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）有着相同的灵敏度，而AP可循环更长时间。荧光的灵敏度更高，但在用于自发荧光的组织时，它又增加了难度。”

自发荧光可以分为两大类：(i) 生物/固有的自发荧光，以及(ii) 固定剂诱导的自发荧光。生物自发荧光通常来源于线粒体、溶酶体以及含有芳香族氨基酸的组分，包括黄素辅酶（FAD、FMN）和吡啶核苷酸（NADH）。

若你希望对同一组织中的多个表位进行染色，那么检测系统的选择尤为重要。你必须决定是同时进行染色还是先后进行染色，并尽量避免试剂之间的交叉反应。

在先后染色时，添加的顺序取决于你所使用的试剂盒。“如果检测系统是不同的（如HRP和AP），那么在下一轮染色之前就要使用染色系统（如DAB或Fast Red），以最大限度地减少不同二抗的交叉反应，”Howat解释说。“如果染色系统是相同的，则需要采取额外的阻断或剥离程序，以便尽量减少交叉反应。”

Howat还强调，在验证所有这些方法时，对照都是至关重要的，可以确保最终图像的准确性。IHC的对照包括内源性组织背景对照、表达对照（阳性对照和阴性对照）、无一抗对照、同型对照和吸收对照。

多重染色

Ultivue公司的研发经理Stephanie Hennek介绍了多重染色和荧光成像的一些要点，该公司专门研究原位的多重免疫染色。

“多重免疫荧光（mIF）染色是一种强大的工具，可以识别各种细胞表型和定位细胞的相互作用，”Hennek解释说。“对mIF来说，重要的是荧光报告基团产生明亮稳定的信号，并且各个通道之间不会发生渗漏，能够很好地区分多个荧光基团。”

Hennek指出，Ultivue的研发人员开发出UltiMapper™ multiplex IF assay，这些检测经过全面优化，可与各种荧光显微镜和扫描仪兼容，实现整块玻片的成像。关于如何减少渗漏（bleed-through）、如何选择染色方法以及mIF对照，他给出了不少实用的建议。

无论你是IHC的新手还是老手，在各个环节都不可掉以轻心。好在，当你遇到麻烦时，Abcam、CST和R&D Systems等公司的支持团队都可以协助你解决各种问题。

多重染色和荧光成像的小贴士

1. 减少荧光基团的光谱渗漏

了解荧光基团的物理性质是开展多重实验时的关键。各个荧光基团的激发光谱和发射光谱应尽量少重叠。显微镜的滤光片和光源必须与每个荧光基团的光谱相匹配，以便分离每个目标的信号。

通常，人们会采取光谱解混（spectral unmixing）来解决渗透/串扰问题。不过，这种操作延长了分析流程，掩盖了原来的生物学，让人们难以比较特定标志物的表达水平。Ultivue的试剂盒采用光谱上分离的荧光基团，从根本上避免了渗漏的可能性。

2. 如何选择染色方法

从通量和生物学的角度来看，优先选择同时染色，而不是依次染色，因为后者可能会掩盖抗原表位。同时染色让所有抗体同时与各自表位相结合，减少了总体的检测时间。Ultivue的技术不需要依次染色程序，即使是高度多重的检测。无论标记物的数量如何，所有目标都被同时染色和放大。这样能够定量评估各个标记的表达水平。

3. mIF实验的关键对照

一些重要的对照可确保多重检测是稳健且可重复的。阳性和阴性对照可确保每个目标的染色特异性，而偶联前和偶联后的染色对照可确保偶联试剂不会影响抗体结合能力。Ultivue在检测开发过程中使用了所有对照。

（作者：Kimberly Dalton / 生物通编译）