赵凯研究员Sci Rep发明多重微滴PCR偶联荧光分光光度法新方法

利用该方法建立的检测技术体系，适合于同时对多靶基因进行定性、定量和高通量检测，极大地提高检测效率、节约了时间、减少了劳动强度和降低了检测成本，可用于所有生物样品中多靶核酸的定性、定量和高通量检测。这是第一次报道可同时对多靶基因进行定性、定量和高通量检测的方法。

　　

上海市农业科学院赵凯研究员在国际期刊Scientific Reports在线发表了题为“A novel emulsion PCR method coupled with fluorescence spectrophotometry for simultaneous qualitative, quantitative and high-throughput detection of multiple DNA targets ”的研究论文。

近年来核酸检测的生物样本量越来越大，而且往往需要定量和高通量检测。传统生物样本定性、定量PCR检测技术每次只能对单个的基因进行检测，而对于生物样本中的成分不明确多靶基因的检测，需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定，周期长，工作量大，成本高。

为了解决这一问题，赵凯研究员在世界上首次提出基于微滴PCR偶联荧光分光光度法的多靶基因同时定性、定量和高通量快速检测理论：不同荧光基团具有不同的波长，用不同的荧光基团标记不同基因的特异性引物，通过微滴PCR进行扩增，不同的PCR产物被不同的荧光基团标记，扩增结束后，在用PCR清洁试剂盒去除多余的引物后，通过多功能酶标仪荧光扫描，根据波长可以对基因进行定性,通过对荧光的强度进行测量，结合标准曲线进而可以实现定量。由于同一个PCR管中多种不同基因由不同荧光标识，因而可以同时检测多种靶基因，进而可以进行高通量检测。

赵凯研究员首次将微滴PCR与荧光分光光度法结合，实现了同时针对多靶基因进行定性、定量和高通量检测的新方法，这是一项国际相关领域突破性的创新技术，具有很高的应用价值。

赵凯研究员对多靶基因定性、定量、高通量检测技术做了大量探索，巧妙地将微滴PCR技术与荧光分光光度法结合，实现了同时针对四种靶基因的定性、定量和高通量检测。而后，以食源性病原微生物为实验材料，开展了一种基于微滴PCR偶联荧光分光光度法的沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的定性、定量和高通量检测技术研究。通过对空白对照荧光强度的统计学分析建立了四种病原菌阳性样品判断标准-阈值。特异性实验表明，沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扩增荧光强度值均大于阈值，显示为阳性，与其它细菌无交叉反应。特异性很好。

同时，他们建立了检测四种病原菌的标准曲线。结果表明，同时检测四种病原菌的检测限均为103拷贝（由于目前没有专用配套的荧光检测仪器，使用的不配套的荧光检测仪灵敏度较低。因而检测的灵敏度较低。），且R2均大于0.999，线性关系良好。重复性实验表明，批内变异系数都在3%以内，说明本研究中建立的实验方法是稳定可靠的，批间的变异系数都在12%以内，同样说明了研究中建立的实验方法的重复性很好。因此，这一实验方法可快速、灵敏地检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，适用于常见食源性病原菌的定性、定量和高通量检测。又以4种转基因玉米为材料进行验证，结果与4种食源性病原菌的检测结果类似，同样验证了这一理论。

微滴PCR技术的采用提高了特异性和反应的通量，同时具有高灵敏度。荧光分光光度法采用Thermo VarioSkan Flash多功能酶标仪实现了对产物基于荧光的定性、定量和高通量检测。研究采用的引物荧光标记法对PCR产物的大小和序列没有要求，是根据标记的荧光基团进行识别的，只要引物特异性好，靶基因能特异性扩增，微滴PCR产物就能识别出来。这对于DNA序列同源性很高，保守区很短的多种基因同时检测优势尤为明显。采用荧光酶标仪对引物荧光标记的微滴PCR产物进行检测非常快速，检测一种基因只需1秒钟时间。

Thermo VarioSkan Flash多功能酶标仪的激发波长范围为200-100nm，适当调整激发和发射波长，可同时检测20种荧光标记物，使用384孔酶标板，则一次可检测6000多种基因。这一方法提高了目标扩增的通量，同时减少了宝贵的试剂和样品的消耗，具有快速，方便，成本低廉，易于推广，环境污染少等优点，可用于所有生物样品中多靶核酸的同时定性、定量和高通量检测。

该论文共同第一作者为上海师范大学杜亚楠硕士和宁夏大学赵笑硕士。上海市农业科学院赵凯研究员为该论文的通讯作者。该研究得到了上海市科委科技创新行动计划项目和闵行区科委产业化项目的支持。

赵凯研究员自2000年起就致力于生物检测试剂盒的研发，现已开发出20余个检测试剂盒，涉及ELISA、金标试纸条、常规PCR、荧光定量PCR、多重PCR、微滴PCR、LAMP、RPA等领域。目前聚焦于检测方法学研究。近年来在国际相关领域前沿期刊Scientific Reports 、PlOS ONE、Regulatory Toxicology and Pharmacology,、Archives of Virology、Virology Journal、Journal of Cereal Science等期刊上发表了多篇重要文章。

目前专利已经授权：一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法（ZL201410022452.X）。

原文检索：

A novel emulsion PCR method coupled with fluorescence spectrophotometry for simultaneous qualitative, quantitative and high-throughput detection of multiple DNA targets. Scientific Reports, (2019) 9:184, DOI:10.1038/s41598-018-36981-1