直接导入Cas9 mRNA或蛋白的CRISPR新手段丨不再脱靶,更高效率!

【字体: 时间:2020年01月07日 来源:锐博生物

编辑推荐:

  这里向大家推荐锐博生物自主研发的包含RNP和全RNA体系的:riboEDIT™ CRISPR-Cas9。相比于复杂的Cas9蛋白大分子,Cas9的mRNA更易成功转染,拥有更高成功率,我们更建议使用全RNA体系!

CRSIPR简介

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),是许多细菌和大多数古细菌中用以抵御噬菌体等外源DNA入侵时的系统。当噬菌体等外源DNA入侵时,它们的CRISPR系统激活,转录出长的RNA前体,然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA,与侵入噬菌体DNA片段存在互补配对并引导Cas蛋白切割。后来,研究人员以此系统删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。

CRSIPR编辑原理

Cas9含有在氨基末端的RuvC、蛋白质中部的HNH两活性位点。crRNA与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)被加工成熟后,crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体。复合体识别并结合于crRNA互补的DNA序列,解开DNA双链形成R-loop结构,crRNA与互补链杂交。随后Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链,RuvC活性位点剪切非互补链,最终引入DNA双链断裂 (DSB),剪切效率堪比限制性内切酶,切割后通过插入一段小的DNA双链即可完成对目的基因的编辑、沉默、激活等。

普遍的CRISPR-Cas9基因编辑技术的利用常以质粒、慢病毒或腺病毒等载体手段进行。而载体的进入往往带来一些不可控的影响,如Cas9或gRNA的表达盒插入基因组未知位点产的影响、Cas9伴随强启动子的参与使Cas9系统长期表达也带来许多脱靶的风险。另外就是载体构建、不同物种启动子筛选和病毒包装的费时费力,以及无病毒实验的要求限制等都是令人发愁的因素。

CRISPR新的操作手段

小编在这里介绍一种更直接简便的手段:全RNA体系与RNP体系

1. RNP体系

直接将Cas9蛋白和向导RNA复合物以化学转染或电转化的手段导入宿主细胞进行编辑。

2. 全RNA体系

将Cas9的mRNA和向导RNA复合物导入宿主细胞进行编辑。

这类方法更安全直接:Cas9的mRNA或蛋白直接进入可立即发挥作用,不存在其他DNA元件影响基因组,不会持续转录,导入的RNA或蛋白在细胞内利用完不会再生,有力减少脱靶效应!

今年5月Cell Stem Cell 一篇文章 Highly Efficient and Marker-free Genome Editing of Human Pluripotent Stem Cells by CRISPR-Cas9 RNP and AAV6 Donor-Mediated Homologous Recombination专门介绍了这种方法对人干细胞进行高效编辑的能力。

今年6月Cell Reports 一篇文章CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection也专门介绍了种方法对小鼠进行编辑的优势!这篇文章以该方法处理受精卵(如下图所示),其发育存活的26个体有9个确认编辑成功。

但想着若要自己分离纯化Cas蛋白或者mRNA是不是很崩溃?

这里向大家推荐锐博生物自主研发的包含RNP和全RNA体系的:riboEDIT™ CRISPR-Cas9。相比于复杂的Cas9蛋白大分子,Cas9的mRNA更易成功转染,拥有更高成功率,我们更建议使用全RNA体系!

什么是riboEDIT™ CRISPR-Cas9体系?

该体系为锐博生物自主开发的CRISPR-Cas9体系(锐博专利号:108977442A),采用天然复合物系统(crRNA和tracrRNA)进行基因编辑,包含Cas9 mRNA的全RNA体系和Cas9蛋白的RNP体系,tracrRNA可实现大规模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,体系中的Cas9 mRNA、tracrRNA,均为优化的RNA产品获得专利认可,高效稳定。针对哺乳动物细胞可简单通过化学转染或电转方式高效便捷地进行基因编辑实验。

riboEDIT™ CRISPR-Cas9体系为即用型,不需要自行构建gRNA表达载体,无需在病毒级实验室中操作,无DNA组分,并且可实现多个crRNA指导下的多靶点编辑,大大简化前期实验准备与操作步骤,更适合于高通量细胞水平的基因敲除筛选,还提供具有编辑效率保证的CRISPR-Cas9套装产品,提供方便、省时、可靠和高效的解决方案。

*效率保证装:按说明书操作条件下,若5条酶切效率低于30%,客户提供转染效率和检测步骤,经技术分析,免费重新优化设计,挑选5条crRNA免费重合并提供实验技术指导。

riboEDIT™ CRISPR-Cas9体系优势

1.锐博专利技术:优化的gRNA(crRNA与tracrRNA)和Cas9 mRNA
2.瞬时表达,有效降低脱靶率
3.无DNA组分,不整合任何病毒或质粒基因
4.编辑效率更高,适用于哺乳动物细胞
5.毒性更低,激活先天免疫反应更小,减少细胞死亡
6.允许一次转染同时靶向编辑多个基因,且毒性更低
7.无需繁琐的克隆构建过程,节约更多人力和时间
8.无需病毒级实验室,大大降低基因编辑对实验环境的要求
9.即用型体系,更加易用,更适合从小规模实验到大规模高通量筛选
10.兼容多种导入模式:化学转染(mRNA转染/蛋白转染)、电转或电穿孔、显微注射等

riboEDIT™ CRISPR-Cas9高效的编辑效率


Fig.1 MHCC97H细胞共转染10pmol riboEDIT™ crRNA、10pmol riboEDIT™ tracrRNA和1ug riboEDIT™ Cas9 mRNA,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。


Fig.2 MHCC97H细胞共转染6pmol riboEDIT™ crRNA、6pmol riboEDIT™ tracrRNA和6pmol riboEDIT™ Cas9 Protein,48小时后 riboEDIT™ T7EI Enzyme酶切检测靶位点的剪切效率,候选7个靶基因的剪切条带及编辑效率。如图所示,#1#2表示同一基因不同位点设计的2条crRNA。


Fig.3 riboEDIT™ CRISPR-Cas9 mRNA基因编辑体系与riboEDIT™ Cas9 RNP复合物具有等同的靶位点编辑效率。

效率保证套装和标准套装

锐博生物提供方便高效的效率保证套装和标准套装。效率保证套装针对人源基因,利用设计软件挑选评分高的5条crRNA进行合成,基于Cas9 mRNA的体系配置必备试剂,包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA转染试剂、阳性对照crRNA套装、T7E1酶及配套缓冲液等,提供即用型的基因编辑工具。其中效率保证套装可以确保MHCC97H细胞的T7E1酶切效率至少1条达到30%以上并提供相应的售后服务(免费重合,技术指导),标准套装不提供任何编辑效率的保证。

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设计合成crRNA

riboEDIT™ Designed crRNA为锐博生物优化的生物信息学设计,客户无需具备crRNA/sgRNA设计经验,crRNA包含20个与目标DNA序列互补配对的核苷酸(原间隔序列)和与tracrRNA互补配对的重复序列,涵盖人类和小鼠基因,每个基因设计合成3 - 6段单独的sgRNA,其他物种crRNA设计需另行评估。

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登录锐博生物官网www.ribobio.com,在产品与服务索引中查找即可进入riboEDIT™ Cas9 mRNA产品介绍。

在这里,您可以选择基因编辑效率保证套装、标准套装、设计crRNA、阳性对照crRNA验证套装、tracrRNA、Cas9 mRNA、 mRNA转染试剂、Cas9蛋白、T7E1酶等体系产品。了解更多riboEDIT™ CRISPR-Cas9信息或免费下载产品说明书,请登录www.ribobio.com

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