CRaft-ID论文揭秘：用微筏阵列(microraft)成像技术进行CRISPR混合文库筛选

最近Nature Methods上发表的一篇文章里面介绍了一种融合CRISPR、高内涵成像和微筏阵列microraft技术的新方法_CRaft-ID。文章的通讯作者Gene Yeo和共同第一作者Emily Wheeler，Anthony Vu介绍了他们发明这种技术的细节，值得我们借鉴。

　　

最近Nature Methods上发表的一篇文章“‘Pooled CRISPR screens with imaging on microraft arrays reveals stress granule-regulatory factors”里面介绍了一种融合CRISPR、高内涵成像和微筏阵列microraft技术的新方法_CRaft-ID。文章的通讯作者Gene Yeo和共同第一作者Emily Wheeler，Anthony Vu介绍了他们发明这种技术的细节。

CRaft-ID是什么

“在这项工作中，我们开发了一个易于使用的工作流程，将CRISPR混合文库筛选技术与高内涵成像和微筏阵列技术相结合，基于图像进行表型筛选。我们将方法命名为CRaft-ID（CRISPR-based microRaft, followed by gRNA identification)）。该方法价格便宜，采用标准实验室设备，可适用于研究多种细胞和亚细胞表型。”

"作为概念验证，我们用CRaft-ID筛选受慢病毒CRISPR文库感染的混合细胞，以鉴定能影响应激颗粒丰度的基因。应激颗粒是在压力（如病毒感染宿主细胞）下细胞质中形成的RNA蛋白质聚集体（其成份大多为核糖核蛋白,RNA结合蛋白、翻译起始因子等,这个聚集区域被称之为应激颗粒stress granules），最好用显微镜进行分析。对于CRISPR混合文库筛选来说，由于标准读数一般包含存活率或荧光标记用于筛选，如何开展成像读数可以说是一个挑战。

为了实现具有成像读数的CRISPR混合文库筛选，我们优化了微筏阵列技术，以便轻松地实现在共享培养基中培养数以千计不同的细胞克隆。我们将载玻片固定在阵列底部，从而首次实现在整个阵列上启用高分辨率自动共聚焦显微镜成像。为了分析成千上万的微孔图像，我们开发了图像处理算法来鉴别那些能符合我们预期的、具有减少应力颗粒形成表型的克隆。然后分离出包含这些克隆的微筏，使我们能够识别和验证出能够影响应力颗粒数量的已知因子和新因子。这说明我们基于图像的CRISPR混合文库筛选方法具有适用性。"

CRaft-ID工作流程。

是什么激发了这种新方法的开发？
CRISPR混合文库筛选是一种强大的工具，可以用于识别对选定表型至关重要的遗传因素。更方便的是，这种方法使我们可以在单个样品中同时检测数千个基因。但是在细胞混合库的微观可视化方面还是受到限制。通过用玻片置底来对微筏阵列进行改良，我们实现了一种可通过基于图像的表型筛选转基因细胞混合库的高通量方法，并且重要的是，这种方法能够轻松分离出感兴趣的克隆进行后续研究。

这将对实验室研究人员产生什么影响？
CRaft-ID将为研究人员提供一种廉价且可行的方式，使他们可以在任何一个标准实验室环境中轻松开展基于图像的CRISPR混合文库筛选。与现有以阵列格式开展的基于图像的筛选相比，我们的工作流程不需要专门的机器人设备来处理数千个单独的孔。灵活的平台可适用于任何CRISPR文库和多种细胞类型，适用于多种细胞表型或亚细胞表型，因此，任何想要用其感兴趣的表型系统地注释基因功能的研究人员都可以轻松地采用这种技术。

该技术显得相对简单，可以在线免费获得该软件。
应用提示或技巧

微筏阵列的操作类似于标准组织培养板，因此可以适用于多种细胞类型。但是要注意，非分裂细胞不适合直接铺板到这上面，因为需要对细胞集落进行成像和基因组DNA分离。对于此类情况，我们建议用户将干细胞或带有增殖细胞的中间体铺在微筏上，并在细胞集落形成后继续分化。

鉴于用慢病毒lentiCRISPR转导细胞进行基因组编辑的效率差异性很高，因此建议对CRISPR混合细胞筛选进行高度覆盖，以增加捕获选定表型的基因敲除的可能性。在我们的筛选中，我们针对每个基因设计了10个独特的sgRNA，并筛选了10倍于文库指引建议的细胞量，从而使该文库中的每个基因获得近100倍表型分析机会。有了这个覆盖范围，我们就能够鉴别能调节应力颗粒丰度的已知因子和新的遗传调控因子。不过，如果需要更高的覆盖范围，则使用者应选择较小的，较为集中的sgRNA文库，或用更多的微筏阵列进行成像。

在开展CRaft-ID筛选之前，请仔细阅读在线提供的详细的分步实验操作手册。

协议中的关键步骤包括：
* 在吊篮式离心机中离心接种在微筏上的细胞，以最大程度地减少细胞粘附在微孔壁上的可能性，避免在成像时导致散焦菌落。
* 铺板到微筏上之前：通过反复移液彻底分离胰蛋白酶消化的细胞，过滤细胞悬液，并以推荐的细胞密度铺板以减少克隆双峰的形成。
* 用靶细胞克隆区分微孔后，立即用快速提取缓冲液进行DNA提取，然后保存在-20°C下以提高基因组DNA提取的效率。
* 在清洁空间中进行DNA提取和第一次PCR反应，以避免文库污染。

采用该方法需要配备哪些设备？
CRaft-ID工作流程使用标准实验室设备和常规市售试剂耗材，CRISPR库无需修改，可用性强。可以通过Cell Microsystems（美国，NC）购买Microraft阵列，并且需要进行简单的改良——将1mm厚的载玻片固定到阵列底部，才能在任何标准的自动共聚焦显微镜上成像。我们用于处理和分析所获取图像的CRaft-ID软件可在开放式GitHub存储库中获得，并可以在任何常规工作站上执行。最后，用户将需要一个电动微针设备和一个手动操纵的磁棒，用于分离包含候选细胞的磁化微筏，以进行基于PCR的测序。可以通过Cell Microsystems商购微针设备和磁棒。

下一步能做什么？
我们用CRaft-ID成功鉴别并验证了能影响应激颗粒形成的新/已知调节因子，我们将使用CRaft-ID来发现消除应力后解决应激颗粒的关键基因。应激颗粒组装和清除的缺陷，与神经退行性疾病和癌症紧密相关，因此鉴定应激颗粒动力学中必不可少的基因，可以揭示与疾病相关的新治疗靶标。我们基于图像的表型筛选的独特功能是能够对荧光标记的亚细胞蛋白进行活细胞成像，然后进行活细胞捕获。通过使用表达荧光标记的应激颗粒蛋白的工程化细胞系，我们现在可以从感染lentiCRISPR的细胞池中可视化应激颗粒行为的实时动态。

我们还希望将CRaft-ID的用途扩展到其他可测量的亚细胞表型，包括细胞内RNA定位。RNA的时空调节对于许多细胞功能（包括细胞运动性，极化和发育）至关重要，因此，我们将致力于使用我们的平台来确定哪些RNA结合蛋白参与了对生物学过程至关重要的mRNA转录本的定位。我们的方法广泛适用于许多环境，我们很高兴将应用这种方法来分析那些能通过高级显微镜技术和图像分析算法进行分析的新表型。

作者简介 
Gene Yeo是加州大学圣地亚哥分校（UCSD; CA，USA）细胞与分子医学教授，是基因组医学研究所的创始成员，也是UCSD干细胞计划和摩尔斯癌症中心的成员。Yeo拥有美国伊利诺伊大学厄本那-香槟分校的化学工程学士学位和经济学学士学位，美国麻省理工学院的计算神经科学博士学位以及美国加州大学圣地亚哥分校拉迪管理学院的工商管理硕士学位。他是一位计算和实验科学家，为RNA生物学和治疗学做出了贡献。他的主要研究兴趣是了解RNA加工的重要性以及RNA结合蛋白（RBP）在发育和疾病中的作用。 

Anthony Vu是UCSD的生物医学科学专业的博士研究生。在加入该计划之前，Vu从UCSD获得了生物学的BS /MS联合学位，在Salk研究所（CA，USA）的Fred Gage实验室完成了硕士论文研究，研究了关键神经元特异性基因阻遏物的分子机制，REST调节神经元发育。在Yeo实验室中，Vu目前正在开发高通量遗传筛选，以研究神经退行性疾病背后的蛋白质聚集机制，从而确定潜在的治疗靶标。他还对设计新工具感兴趣，以表征对神经元功能和健康至关重要的RNA-蛋白质复合物的时空调控。自2019年以来，Vu是NSF GRFP研究员和ARCS学者。

Emily C Wheeler从UCSD获得了生物医学科学博士学位。在Yeo的实验室中，她的论文工作重点是使用计算和分子生物学工具来揭示细胞中蛋白质与RNA的相互作用如何在癌症和神经退行性变中发挥作用。具体来说，她的工作包括发现新颖的RNA结合蛋白，这些蛋白对于在运动神经元中形成蛋白聚集体（在肌萎缩性侧索硬化症中引起细胞死亡）至关重要。此外，她开发了计算方法来确定血液癌症中发生的剪接因子中的点突变如何改变其与细胞RNA的相互作用。自2017年以来，她一直是NSF GRFP研究员和ARCS学者。