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分子互作,文章加分法宝——新手篇

【字体: 时间:2020年10月23日 来源:吉凯基因

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  提起分子互作,不可避免的要提起中心法则中的三大主体:DNA,RNA和蛋白质。分子互作就是指三大主体之间的相互作用。今天小编就给大家来介绍下不同分子间互作可以采用的方法。

提起分子互作,不可避免的要提起中心法则中的三大主体:DNA,RNA和蛋白质。分子互作就是指三大主体之间的相互作用。今天小编就给大家来介绍下不同分子间互作可以采用的方法。

一、蛋白与蛋白的互作

蛋白与蛋白之间的互作,目前主要在实验室中开展的有以下几个实验:

1、酵母双杂交实验:酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆(融合)到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。采用蛋白之间能相互作用使转录激活因子DNA结合功能域及转录激活域形成融合蛋白,激活报告基因转录的方法。

该法优点:基于文库大批量筛选相互作用的蛋白,灵敏度高,且能找到相互作用的片段。不依赖于抗体。缺点:自身具有转录功能的蛋白会造成假阳性;融合蛋白的构象易发生改变,造成结果的可靠性降低,结果需进一步验证。常用于大量筛选。

实验注意点:因有些蛋白可能本身具有转录活性,因此需在不同的酵母生长系统中多次验证。例如下方文献中提到的含半乳糖和棉子糖(gal/raf)的培养基及另一种含葡萄糖(glu)的抑制型培养基。

2、IP:采用饵蛋白的抗体钓体内已存的复合物,找到与饵蛋白相互作用蛋白的方法。根据互做蛋白是否已经已知,可把IP后的检测分为质谱检测或是WB检测,对应的技术就是IP-MS和CO-IP 二个实验。

该法优点:复合物的形式是生理情况下天然存在的。缺点:蛋白与蛋白之间可能非直接相互作用,而是通过其它蛋白介导而形成的复合物,不能用于直接作用的验证。常用于相互作用蛋白的筛选及验证。

实验注意点:蛋白复合物为天然存在,蛋白裂解过程不能使用强裂解液,尽量使用中等强度或是IP专用裂解液。蛋白为天然构象蛋白,抗体需使用IP级别抗体。 Protein A或是G 对抗体有不同的偏好性,protein A对兔来源的抗体有较高的亲和力,而Protein G对鼠抗有更高的亲和力,因此尽量选择proteinA/G 的珠子。对于一触即分的蛋白互作研究,例如酶和底物等,可采用突变的方法进行研究。

3、Pull down:外源表达饵蛋白,带上标记(常用GST标记或是his标记),采用饵蛋白在体外钓鱼的形式,确认相互作用蛋白的方法。

该法优点:鉴定的蛋白是直接作用的蛋白,非间接作用的复合体。GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白,使实验变得更易操作。缺点:二个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性,需进一步验证,例如CO-IP再次验证。常用于蛋白相互作用间的验证。

实验注意点:饵蛋白为外源表达,需注意表达条件,不能形成结构不定的包涵体形式。 另GST为酶蛋白,拉取效率受其亲和力的影响。

4、荧光共振能量转移技术:蛋白之前的距离足够近时(<10nm),可使供体蛋白的荧光“转移”至受体蛋白的荧光中,发生荧光的能量转移。优点:灵敏,能够研究大分子的构象变化。缺点:仪器贵。

举一篇文章中的例子:为找到星形胶质瘤中FOCAD的相互作用蛋白,采用酵母双杂交实验,以FOCAD为饵蛋白,人脑CDNA文库为猎物蛋白,并通过在gal/raf 或是glu的不同条件培养基下实验,同时再次以阳参p53/LTA验证,确认TUBB6为FOCAD的相互作用蛋白。最后通过IP 方法验证FOCAD与TUBB6之间存在相互作用。

Brand, F., Förster, A., Christians, A., Bucher, M., Thomé, C. M., Raab, M. S., … Weber, R. G. (2019). FOCAD loss impacts microtubule assembly, G2/M progression and patient survival in astrocytic gliomas. Acta Neuropathologica. doi:10.1007/s00401-019-02067-z

二、蛋白与RNA的互作

蛋白与RNA之间的互作研究,目前主要所用的方法如下:

1、RIP:(RNA binding protein )采用蛋白的抗体为饵,钓取体内现存蛋白-RNA复合物的方法。常与RNA pull down实验结果互相验证。

注意事项:因原理基于IP实验,注意事项同IP实验。同时注意避免RNase对RNA的降解作用。因RNA与蛋白的亲和力不同,可采用不同的方法来研究,研究与蛋白结合力弱的RNA,可采用交联后再进行RIP的方法,而研究与蛋白结合力强的RNA可直接采用native的方法。

2、CLIP:采用UV的方法交联细胞内的RNA-蛋白, 再以蛋白抗体为饵,钓取蛋白-RNA复合物。现在亦可用于RNA-RNA 之间的研究。现在还有很多的衍生实验,例如eCLIP,iCLIP等。优点:无需考虑强弱亲和力的影响。缺点:比RIP的方法麻烦。后续检测若采用测序分析,则目前没有用于clip-seq 数据分析的通用标准,无法对其进行定量。

3、RNA pull down:体外合成带标记RNA为饵,体外拉取可与此RNA结合的蛋白。

该法优点:外源的RNA,与细胞内RNA的含量无关,可研究一些细胞内表达丰度较低的RNA。缺点:基于pull down的原理,缺点为结合为非生理条件下进行,会出现假阳性结果。需再次验证。常用来研究lncRNA或是miRNA与蛋白的相互作用。

注意事项:注意避免RNase 对探针的降解作用。

4、ChIRP:采用一系列短探针为饵,钓取体内现在蛋白-RNA复合物的方法。

该法优点:生理条件下存在的蛋白-RNA复合物。缺点:探针为短序列,效率较低,所需细胞量较多。

四个实验基于已知物不同可分为二类。一类蛋白已知,需找到与蛋白相作用的RNA,可采用RIP,CLIP等方法;另一类RNA已知,需找到RNA 的结合蛋白,可采用RNA pull down及ChIRP的方法。

参考circulation上的一篇文献,文中研究CPR可影响心肌细胞的增殖。确认功能后进一步探索机制。RIP实验发现Dnmt3a及Dnmt1及3b均可与CPR结合,用RNA pull down反向验证发现Dnmt3a 可与CPR结合。 采用截断体研究发现CPR的3‘末端区域与Dnmt3a 结合。

三、蛋白与DNA的互作

蛋白与DNA之间的互作,目前所采用的主要研究方法如下:

1、ChIP:采用甲醛交联(有些强亲和力的蛋白例如H3组蛋白等可不交联),而后蛋白抗体拉取蛋白-DNA复合物,而后通过检测DNA的一种验证蛋白与DNA的作用。

该法优点:生理条件下直接的结合作用,不受结合能力强弱的影响。缺点:ChIP 实验的抗体要求较高。

实验注意点:研究转录因子与DNA的结合,尽量采用超声的方法进行打断,超声的条件需要控制,大小需在1000bp以下,300-700bp的大小较佳。同样基于IP实验的原理,注意事项同IP实验。

2、EMSA:采用标记的DNA探针与抗体分别与DNA-蛋白复合物结合,通过不同的泳动速度而确认DNA是否与蛋白相结合的方法。亦可用于RNA 与蛋白的相互作用研究。

3、Luciferase:采用外源报告基因的表达量来研究DNA片段是否与蛋白结合的一种研究方法。待测DNA片段放入报告基因的启动子区,改变蛋白表达量而观察报告基因表达量是否改变来确认是否具有相互作用。

该法优点:实验简单,易操作。缺点:外源条件模拟,非天然存在。常和ChIP 实验或是EMSA 实验联合验证。

实验注意点:Luciferase实验的结果以酶与底物反应的酶活数值而展现,受到酶活的影响,且有一定的基底值,需实验组数据尽量在10000以上。 影响酶活的操作均会影响Luciferase实验的结果。

除上述一些常用的实验之外,还有比较多的研究分子互作之间的方法,例如RNA与RNA或蛋白之间的相互作用除了提到的CLIP之外,还有CLIP的衍生技术例如HITS-CLIP/PRP-CLIP,GoldCLIP等等。另外DNA与RNA之间的研究方法有GRID-Seq等。我们下次再进行分享。

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