Nat Commun：复旦和南大学者揭示脂肪酸吸收的关键调控机制

　　

脂肪酸（FA）在体内具有重要功能，可作为能量来源，并参与生物膜合成和能量存储。然而，脂肪酸如何跨过细胞膜进入细胞内，目前仍不太清楚。与葡萄糖和氨基酸不同，脂肪酸具有疏水性，这使得其运动难以追踪。有人认为，脂肪酸是经过被动扩散穿过细胞膜，但越来越多的证据表明，脂肪酸是在蛋白的参与下完成代谢组织的跨膜转运。

在已知的脂肪酸转运蛋白中，CD36是研究相对较多的一个。它主要定位于细胞膜上的caveolae凹陷结构，且脂肪酸吸收活性也依赖caveolae结构。小鼠脂肪和肌肉组织中大约50%的脂肪酸吸收是由CD36贡献的。CD36有一个脂肪酸结合位点，但具体如何转运脂肪酸，现在还是个谜。

复旦大学代谢与整合生物学研究院的赵同金课题组之前发现，两个棕榈酰基转移酶DHHC4和DHHC5分别在高尔基体和细胞质膜上对CD36进行棕榈酰化修饰，从而维持CD36的质膜定位并促进其脂肪酸吸收的活性。

最近，赵同金课题组与南京大学模式动物研究中心的陈帅课题组合作，进一步研究了CD36促进脂肪酸吸收的方式。他们发现，脂肪酸可通过CD36介导的内吞作用转运到细胞内，而CD36的动态棕榈酰化在这一过程中发挥关键作用。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上。

CD36介导的内吞作用将脂肪酸转运到细胞

为了研究脂肪酸吸收期间CD36的亚细胞定位变化，研究人员用BSA偶联的油酸处理3T3-L1脂肪细胞，并开展内源性CD36的免疫染色。他们发现，从油酸处理后30分钟开始，CD36被内化并在细胞内显示出点状信号。到1小时，CD36开始包裹脂滴，并在2小时和4小时变得更明显。

由于CD36主要定位在caveolae凹陷结构上，故研究人员也分析了caveolae结构蛋白Caveolin1（CAV1）的动态定位。他们发现CAV1与CD36共同迁移。考虑到CD36的脂肪酸结合位点位于质膜外侧，而CAV1位于内侧，他们猜测CD36和CAV1在内化时相互依赖，其中CD36作为受体接受脂肪酸的信号，而CAV1提供结构上的支持。确实是这样，当脂肪细胞中的任一个被敲除时，另一个在油酸处理后也不再内化，这表明它们的内化源于CD36介导的caveolae内吞作用。

之后，他们选择PacFA作为脂肪酸类似物来追踪脂肪酸在细胞内的运动。如图1所示，PacFA是一种可以光活化的脂肪酸类似物，可参与点击反应。他们用PacFA处理脂肪细胞20分钟，然后利用N3-Alexa Fluor 488开展点击反应以标记PacFA，并对CD36进行免疫染色。通过这种方式，他们观察到了PacFA和CD36的清晰定位。在定量时，大约56%的PacFA与细胞内部的CD36结合。

为了进一步确认CD36通过内吞作用促进脂肪酸吸收，研究人员试图敲除CAV1，看看对内吞作用的阻断是否会破坏脂肪酸吸收。他们在Cav1^−/−小鼠（赛业生物提供）、 Cd36^−/−小鼠以及 Cav1^−/−;Cd36^−/−小鼠的脂肪细胞中开展³H-油酸吸收实验。与野生型脂肪细胞相比，Cav1^−/−脂肪细胞中的³H-油酸吸收降低40%。同时，双重敲除并没有进一步降低³H-油酸的吸收，表明caveolar内吞是CD36依赖的脂肪酸吸收所必需的。

图1. CD36介导的caveolar内吞将脂肪酸转运到细胞

CD36的动态棕榈酰化是脂肪酸吸收所必需的

之后，研究人员想了解CD36如何从质膜上解离。由于CD36的质膜定位需要棕榈酰化，因此他们想看看CD36在内化之前是否会去棕榈酰化。在油酸处理后5分钟内，CD36的棕榈酰化水平开始降低，并在30-60分钟左右达到最低点。DHHC5的棕榈酰化也有类似的观察结果。从培养基中去除油酸时，CD36和DHHC5被重新棕榈酰化，这表明CD36和DHHC5在脂肪酸诱导的内吞过程中经历了棕榈酰化的动态变化。

接着他们解析了CD36内吞的信号通路。首先鉴定了CD36的去棕榈酰化酶，目前主要有五种，包括APT1、APT2和ABHD17A–C。通过PalmB抑制等实验，他们发现APT1是CD36的去棕榈酰化酶。然后，他们敲除了3T3-L1脂肪细胞中的APT1或采用APT1抑制剂处理，发现APT1的敲除或抑制均可阻断油酸诱导的CD36内化和去棕榈酰化（图2）。

 
图2. CD36的去棕榈酰化是脂肪酸内吞所必需的

那么是什么导致了CD36的去棕榈酰化。研究人员猜想，DHHC5可能被灭活，因为DHHC的自身棕榈酰化是催化底物棕榈酰化的第一步。后续的研究发现，在油酸处理5分钟后，DHHC5上Tyr91位点的磷酸化显著增加，而30分钟后降至基底水平。他们还证实，DHHC5的动态失活是CD36内化所必需的。

于是，下一个目标是鉴定将DHHC5磷酸化的激酶。他们敲除了3T3-L1脂肪细胞中丰度相对较高的四个Src家族激酶（SFK），发现LYN的敲除可抑制油酸诱导的DHHC5磷酸化。利用两个shRNA敲除LYN后，油酸诱导的CD36内化以及CD36和DHHC5的去棕榈酰化被阻断，证实LYN可在Tyr91位点将DHHC5磷酸化。

不过，CD36的去棕榈酰化如何启动内吞作用呢？研究人员首先研究了dynamin、VAV和JNK的招募，这些蛋白曾被报道参与了CD36的内吞作用。利用各个蛋白的抑制剂处理后，他们发现所有抑制剂均能阻断油酸诱导的CD36内吞作用。同时，油酸处理导致VAV和JNK的磷酸化增加，表明CD36的去棕榈酰化需要招募这些蛋白。

通过进一步的研究，他们发现酪氨酸激酶SYK在油酸处理后被激活，并招募到质膜上。SYK抑制剂（piceatannol）的处理在很大程度上消除了油酸诱导的VAV和JNK磷酸化以及CD36的内化，但并不影响CD36去棕榈酰化，表明SYK激活是CD36去棕榈酰化的下游事件。SYK将VAV和JNK磷酸化，从而启动CD36介导的内吞作用。

内吞作用的阻断可抑制CD36的生理功能

最后，研究人员评估了CD36介导的脂肪酸内吞有何生理意义。由于脂肪酸吸收的主要功能是将脂肪酸储存在脂肪细胞的脂滴中，因此他们探讨了内吞作用的阻断对脂滴生长有何影响。与野生型脂肪细胞不同，Cd36−/−脂肪细胞经过油滴处理后几乎没有明显的脂滴生长，表明内吞作用的阻断可以消除CD36依赖性的脂滴生长。此外，通过靶向LYN或SYK来阻断内吞作用，也能够抑制饮食诱导肥胖小鼠的体重增加。

小结

在此项研究中，研究人员提出了CD36介导脂肪酸吸收的工作模型（图3）。当脂肪酸与CD36结合时，其下游激酶LYN被激活，并对DHHC5进行磷酸化使其失活，从而导致APT1对CD36的去棕榈酰化。去棕榈酰化的CD36随后招募另一种酪氨酸激酶SYK，使VAV和JNK磷酸化，从而启动CD36介导的内吞作用。内吞的囊泡将脂肪酸运输到脂滴进行储存。之后，CD36被重新棕榈酰化并循环到质膜，开始下一轮的运输。

 
图3. CD36介导的caveolar内吞促进脂肪酸吸收的工作模型

（生物通 余亮）

原文检索

Hao, J., Wang, J., Guo, H. et al. CD36 facilitates fatty acid uptake by dynamic palmitoylation-regulated endocytosis. Nat Commun 11, 4765 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18565-8