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Odyssey On/In-Cell Western技术助力筛选下调PD-L1表达的激酶抑制剂

【字体: 时间:2020年12月18日 来源:基因有限公司

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  Odyssey On/In-Cell Western (O/ICW)筛选系统,用于识别下调肿瘤细胞PD-L1水平的小分子化合物,具有较高的灵敏度,结果更精确,通量更高,重复性更好,方便快捷。

蛋白激酶已成为许多疾病中重要的细胞调节蛋白。激酶直接或间接控制大多数细胞过程,包括代谢,转录,细胞周期进程,细胞骨架重排,细胞凋亡和分化,信号传导等。因此,蛋白激酶已逐渐成为药物开发的主要目标,其中激酶抑制剂已成为治疗癌症最重要的药物之一。

程序性死亡-1(PD-1)与其配体(PD-L1)的相互作用是一个重要的免疫检测点,在临床上,用抗PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用具有良好的抗肿瘤活性。但是,抗体阻断只对一小部分患者有用。近年来,小分子激酶抑制剂被广泛应用于抗肿瘤药物,有多种激酶抑制剂被报道抑制PD-L1的表达。然而,PD-L1表达与激酶抑制剂之间的关系还没有完全阐明。因此,研究激酶抑制剂治疗与PD-L1/PD-1阻断的相关性将是一个有趣的问题。本文作者基于Odyssey On/In-Cell Western (O/ICW),建立了一个新的、强大的筛选系统,用于识别下调肿瘤细胞PD-L1水平的激酶抑制剂,具有较高的灵敏度,结果更精确,通量更高,重复性更好,方便快捷。除激酶抑制剂外,该筛选系统还可用于筛选其他类型的小分子,例如可有效筛选下调PD-L1表达的合成化合物或天然产物等。

一、在HT-1080细胞系中建立基于Odyssey On/In-Cell Western 的检测方法筛选PD-L1的下调剂

为了评价激酶抑制剂对PD-L1在细胞膜上表达的影响,作者用Odyssey On/In-Cell Western建立了筛选系统。首先,寻找一个PD-L1高表达水平的细胞系,通过免疫印迹的方法分析了包括DU-145、PC-3、22RV1、HT-1080、H1299、H1975、H-460、A-549和HeLa等多个癌细胞系中PD-L1蛋白水平,结果表明HT-1080细胞株的PD-L1蛋白水平明显高于其他细胞系(图1a)。另外,HT-1080对聚苯乙烯具有良好的附着力,适合在96孔板中培养。因此,作者选择HT-1080建立Odyssey On/In-Cell Western分析方法。

然后,为了验证Odyssey On/In-Cell Western分析的有效性,作者使用western blot(图1b)和Odyssey On/In-Cell Western分析(图1c)比较HT-1080和PC-3的PD-L1水平。结果表明,HT-1080的PD-L1水平远高于PC-3,说明所建立的Odyssey On/In-Cell Western筛选系统是可靠的。另外,据报道IFN-γ可诱导PD-L1的表达,而CDK5抑制剂则会导致PD-L1的减少。因此,作者进一步使用IFN-γ和dinaciclib(一种有效的CDK5抑制剂)来评估Odyssey On/In-Cell Western筛选系统。Odyssey On/In-Cell Western实验结果(图1e),表明IFN-γ能有效地提高HT-1080中PD-L1的水平,dinaciclib能显著抑制PD-L1的表达,这与以往的报道一致,与western blot(图1d)的结果相当。综上所述,表明已建立的Odyssey On/In-Cell Western筛选系统可以方便地用于鉴定抑制细胞表面PD-L1表达的小分子。


图1:建立用于检测HT-1080细胞中PD-L1表达下调的Odyssey On/In-Cell Western筛选系统

二、Odyssey On/In-Cell Western法筛选激酶抑制剂库

使用Odyssey On/In-Cell Western筛选系统来检测小分子激酶抑制剂对HT-1080细胞系细胞表面PD-L1表达的影响。对激酶抑制剂库进行筛选,其中包括430种靶向具有高结构多样性的激酶库的抑制剂。考虑到激酶抑制剂的潜在细胞毒性,分别用10 nM、100 nM、1µM和10µM的不同剂量筛选文库,仅收集细胞毒性可忽略的用量进行进一步分析。根据抑制剂治疗组β-actin的荧光强度与DMSO对照组荧光强度的比值来评价小分子的细胞毒性。如果比值小于0.5,我们认为抑制剂具有严重的细胞毒性(图2a)。然后,选择了与对照组(DMSO)相比,能够使PD-L1表达降低20%以上的小分子激酶抑制剂,在1µM和10µM用量下分别有43种和59种小分子激酶抑制剂使细胞表面PD-L1降低(图2b,c)。共有102种抑制剂可导致PD-L1降低20%以上,占激酶抑制剂总量的23.7%,从而突显了蛋白激酶与PD-L1表达调控之间的紧密联系。


图2:基于Odyssey On/In-Cell Western的高通量筛选用于抑制HT-1080细胞表面上PD-L1表达的小分子

三、通过Odyssey Western Blot确认PD-L1下调的激酶抑制剂

筛选到的抑制剂根据其作用功能被进一步分到不同的激酶组,对于每一组,选择一个代表做进一步确认。选择了28种可降低细胞表面PD-L1表达的小分子激酶抑制剂进行Odyssey Western Blot分析。将PD-L1的整合荧光强度与β-actin的整合荧光强度进行均一化,将对照组(DMSO组)设为100%。结果表明,约有18个化合物对PD-L1的表达具有抑制作用,其作用靶点包括MEK、EGFR、AKT和ATM等。


图3:用Odyssey Western Blot法检测HT-1080细胞PD-L1的表达

四、所选激酶抑制剂的流式检测  

由于PD-L1是一种跨膜蛋白,它通过其胞外结构域与PD-1相互作用在细胞膜上发挥作用。因此,作者进一步用流式细胞术检测细胞膜上PD-L1的水平。14种激酶抑制剂(包括Cobimetinib、AT7519、Lapatinib、ERK5-in-1、LY2090314、vaccinol-1、GSK2334470、Uprosertib、KU-60019、ZM447439、FIIN-2、CYT387、Fingolimod、Fostamatinib)均能明显降低细胞膜PD-L1的水平,且大部分与Odyssey Western Blot结果一致。


图4:流式细胞仪检测HT-1080细胞PD-L1的表达

五、协同作用评价实验

用Odyssey Western Blot法进一步评估了HT-1080细胞中ATM抑制剂(KU-60019),MEK抑制剂(Cobimetinib)和JNK抑制剂(Vacquinol-1,MKK4激活剂)对PD-L1的协同抑制作用。用KU-60019和Vacquinol-1共同处理HT-1080细胞后,PD-L1的表达水平显著降低。而KU-60019与Cobimetinib共处理或KU-60019与Cobimetinib共处理的抑制效果没有明显的协同作用(图5a,b)。接下来,作者在H460细胞中测试了这三对化合物的协同效应,得到了相似的结果(图5c,d)。只有KU-60019和Vacquinol-1联合处理对PD-L1的表达有显著的协同抑制作用。


图5:ATM抑制剂、MEK抑制剂和MKK4激活剂协同下调HT-1080细胞和H460细胞PD-L1

总之,在本文中,作者建立了一种Odyssey On/In-Cell Western分析法来评估PD-L1在细胞表面的表达水平。这种基于细胞的检测结合了Western Blotting的特异性和ELISA的重复性和高通量,可以快速定量监测细胞表面蛋白的表达。与WB相比,Odyssey On/In-Cell Western的优势在于其高通量的能力,更高的精度以及减少的样品制备要求。 Odyssey On/In-Cell Western对于低数量的样本或需要大量样本的流程可能会提供更好的灵敏度和精度。并且建立的Odyssey On/In-Cell Western筛选系统被证明是评估PD-L1蛋白质水平的一种强大、便捷的方法。除筛选激酶抑制剂外,还可用于筛选其他类型的小分子,如合成化合物或天然产物等。

On/In-Cell Western是由LI-COR公司研发的一种直接在微孔板内(96/384孔板)对细胞内目标蛋白进行定量免疫荧光检测的方法。On/In-Cell Western无需进行裂解细胞、制胶、电泳、转膜等步骤,不仅节省了大量时间,而且大大提升了实验通量和重复性,能更好地助力激酶信号通路和药物功效检测。

微孔板内的细胞经过固定、透化、一抗、二抗孵育、洗涤等步骤后,即可在Odyssey双色红外激光成像系统上对微孔板进行扫描成像,实现对细胞内目标蛋白的精确定量。

基因有限公司作为LI-COR产品中国区代理商,与LI-COR一起邀请您关注近红外荧光成像技术在Western Blot准确定量、磷酸化等蛋白修饰化研究、On/In-Cell Western、双色EMSA、蛋白芯片及光免疫疗法等方面的应用进展。欲进一步了解详细内容,请关注我们的官方微信“基因快讯”或联系您身边的基因有限公司工作人员。

参考文献:

[1] Xie Y , Ding J , Cui X , et al. Screening of kinase inhibitors downregulating PD-L1 expression via on/in cell quantitative immunoblots[J]. European Journal of Pharmaceutical ences, 2019, 142:105088.


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