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利用CRISPR平台来快速检测新冠病毒

【字体: 时间:2020年04月23日 来源:生物通

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  科学家利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单而经济的平台(包括SHERLOCK和DETECTR),能够可靠检测极低浓度的核酸。这两个系统的开发者近日都发布了快速检测新冠病毒的方案。

新冠肺炎疫情的暴发,凸显出核酸检测的重要性。灵敏而特异的核酸检测,对于临床诊断和基因分型都至关重要。不过,许多核酸检测方法缺乏检测低浓度核酸的灵敏度或特异性,或者过于昂贵和复杂,在标准实验室之外无法使用。对于新型冠状病毒,qPCR虽然是诊断金标准,但在疫情刚刚暴发时,许多国家都面临检测试剂不足的问题。

好在,科学家利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单而经济的平台,能够可靠检测极低浓度的核酸。正如我们之前所介绍的,Broad研究所的张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发出SHERLOCK和SHERLOCK v2方法;而加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室则开发出一种称为DETECTR的方法。

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA进行切割和降解,以此切割和激活报告基团。随后对这个报告基团产生的信号进行测定,即可确定感兴趣的DNA或RNA是否存在。这两个系统的开发者近日都发布了快速检测新冠病毒的方案。

SHERLOCK

下面我们先来回顾一下SHERLOCK的工作原理。在crRNA的引导下,Cas13识别目标序列并结合,这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。SHERLOCK系统将荧光淬灭的ssRNA报告基团添加到反应中。激活的Cas13切割RNA后,产生可定量的信号,表示目标核酸的存在。

为了提高分析的灵敏度,样品中的DNA或RNA首先经过重组酶聚合酶扩增(RPA)或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合,将扩增后的DNA转化为RNA,便于后续的Cas13检测。这种扩增步骤使得SHERLOCK的灵敏度达到渺摩尔(attomolar,10-18 M),特异性达到单碱基错配。之后,他们又开发出灵敏度更高的多重检测平台SHERLOCK v2。

在新冠肺炎疫情暴发后,张锋等人共享了利用SHERLOCK检测SARS-CoV-2 RNA的操作方案1。该检测利用从患者样本中纯化出的RNA作为起始样本,通过试纸条浸润来读取检测结果,而无需进行复杂的仪器操作。

具体检测方案分为三个步骤,可在一小时内完成。

第1步:孵育25分钟 – 利用市售的PRA试剂盒等温扩增核酸样品;
第2步:孵育30分钟 – 利用Cas13检测预扩增的病毒RNA序列;
第3步:孵育2分钟 – 利用试纸条肉眼观察检测结果

DETECTR

DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列,同时将ssDNA-荧光淬灭(FQ)报道基团加入反应中,它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵敏度,首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-crRNA与目标dsDNA配对时,Cas12a的DNase活性启动。随后,周围的ssDNA被降解,包括ssDNA-FQ报道基团在内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。

DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸,适合一系列分子和临床诊断应用。基于DETECTR技术的Mammoth Biosciences公司已成立,它的目标是提供基于CRISPR的平台 ,并以此为基础开发各种生物传感的检测。

近日,Mammoth Biosciences和加州大学旧金山分校的研究人员借助DETECTR平台,开发出SARS-CoV-2的快速检测。这项成果发表在《Nature Biotechnology》杂志上2

SARS-CoV-2 DETECTR的流程如上图所示。从患者的鼻咽拭子中提取RNA之后,将其作为DETECTR的起始材料。之后进行LAMP预扩增,并利用Cas12检测病毒的E基因、N基因和RNase P,最后通过荧光分析仪或侧向流检测试纸来查看结果。整个过程可在一小时内完成,也不需要复杂的仪器。不过,与SHERLOCK系统一样,DETECTR也尚未经过批准用于临床诊断。(生物通 薄荷)

参考文献

1. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e7773f40df723159b16f262/1584886772519/COVID-19+detection+%28v.20200321%29.pdf
2. Broughton, J.P., Deng, X., Yu, G. et al. CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4

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