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网红m6A RNA甲基化来了——m6A RNA甲基化课题如何设计

【字体: 时间:2020年04月22日 来源:吉凯基因

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吉凯基因2月26号做了一场关于m6A RNA甲基化修饰研究的网络直播课,小编都不得不感叹,现在连科研都走上了网红这条路,网络直播课的人气分分钟过万。(有图有真相)

下面我们就来简单回顾一下这么一堂人气过万的网络直播课,到底具体讲了什么内容呢?

第一部分:介绍了m6A RNA甲基化的背景和研究现状

RNA的修饰属于表观调控的一部分,已经发现的RNA修饰种类至少超过100种,分布于各类RNA分子中,其中最受关注的依然是存在于mRNA上的修饰。然而由于total RNA中mRNA比例很低,携带有特定RNA修饰的mRNA比例更低,所以目前还有很多RNA修饰还缺乏高效的检测手段,目前已经发现的有检测手段的RNA修饰主要有:m1A,m5C,m6A,m7G,ac4C等,其中m6A修饰是目前发现的丰度最高的一种RNA修饰,m6A mRNA修饰主要发生在翻译终止位点附近motif区域;研究发现m6A的修饰不仅仅发生在mRNA的水平,在非编码RNA上同样也有m6A的修饰位点。

m6A修饰是可逆的,受到动态调控,与m6A修饰相关的蛋白被分为三类,分别是writer、reader、earser;其中writer蛋白主要负责在RNA上加上m6A的修饰,earser蛋白主要负责去除RNA上的m6A修饰;reader蛋白主要是使m6A修饰发挥功能,所以m6A修饰具体发挥什么样的生物学功能,reader蛋白发挥着关键的作用。


图1 m6A调控过程    Deng X, et al. Cell Research (2018)

第二部分:meRIP-seq测序技术原理

目前检测m6A RNA甲基化修饰的主要技术有meRIP-seq,miCLIP,LC-MS,meRIP-qpcr,这里主要介绍一下当前主流的技术meRIP-seq(methylated RNA immunoprecipitation sequencing)高通量测序技术。其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀,将富集下来的带有m6A修饰的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析,即可在转录组范围内对RNA的m6A修饰进行系统研究。

我们最新开发的微量 meRIP-seq 技术,仅需 500ng-20μg总RNA 即可满足实验要求,利用最新的去 rRNA 技术,提高了rRNA的去除效率;并且可以同时检测 mRNA和非编码RNA的甲基化修饰谱,帮助老师们对 RNA 甲基化修饰图谱进行全面研究。具体流程如下:

第三部分:m6A RNA甲基化的研究方案和应用场景

通过文献调研发现,目前m6A RNA甲基化的研究思路主要是两个方向。

1、绘制甲基化图谱(筛选疾病标志物)

研究思路:

应用场景:

研究目的:确定m6A RNA甲基化修饰在心肌肥大中的作用。

研究方法:分离正常的新生大鼠和心肌肥大的新生大鼠的心肌细胞,抽提RNA,经过m6A特异性抗体富集以后,进行meRIP-seq(m6A RNA甲基化测序)

通过生物信息学分析,如图所示:对这些m6A修饰的峰在基因上的总体分布进行了展示;评估了在心肌肥大过程中RNA中m6A修饰的RNA的总体百分比(figA),发现在心肌肥大过程中m6A修饰的mRNA占比是增高(figB)。在肥大性心肌细胞中,m6A变化并非随机分布在整个基因组中,而是在特定类别的mRNA中特异性增加,其中蛋白质激酶和修饰的相关基因,在肥大心肌细胞中显著富集(figC);figD和E展示了m6A甲基化峰在正常心肌细胞和肥大心肌细胞中没有差异的基因(如Ryr2),和有差异的基因(如Map3k6)。

文章思路:正常原代心肌细胞vs肥大原代心肌细胞——meRIP-seq——生物信息分析结果展示——meRIP-QPCR验证

2、功能机制研究

研究思路:

应用场景:

研究目的:探索m6A去甲基酶ALKBH5在胶质母细胞瘤中的功能,深入研究m6A RNA甲基化在胶质母细胞瘤中的关键作用机制

为了探究ALKBH5的作用机制,在两株GSC细胞中下调ALKBH5,NC组vs KD组,进行普通转录组和m6A-seq检测,首先转录分析NC和KD组,在两株GSC细胞中,2倍以上的差异基因有206个。同样在m6A-seq的测序数据中,对Input部分的数据进行分析,2倍以上的差异基因148个,和普通转录组的206个基因进行overlap,有同向调控作用的基因有85个,这85个转录组得到的差异基因再和m6A-seq的unique peak进行比对,最后发现既有2倍上调,又有m6A修饰显著差异的基因有12个,另一方面对转录的那206个差异基因,用IPA的上游调控分析模块分析,结果发现上游调控因子只有FOXM1是落在这12个基因里面的,所以接下来的研究集中在FOXM1这个潜在的重要靶基因上。

文章思路:5大公共数据库寻找研究目标——确认m6A去甲基化酶ALKBH5——qPCR/WB/IHC 验证ALKBH5在细胞和临床样本中表达情况——KD/OE调控ALKBH5,细胞动物验证功能——RNA-seq/meRIP-seq联合应用寻找机制

m6A RNA甲基化作为这两年高分paper和国自然青睐的热门研究方向,很多老师也都希望在自己的课题设计上有所突破,才导致了老师们如此高的热情来听我们的讲座。

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吉凯基因提供MeRIP-seq m6A RNA甲基化高通量测序,以及传统的基因组、转录组、蛋白组、表观遗传等高通量组学检测服务,竭诚为各位老师的科研助力。

 

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