李辉教授团队:从融合基因意外发现胶质母细胞瘤新靶标

【字体: 时间:2020年07月16日 来源:弗吉尼亚大学

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  研究首次报道AVIL作为一个细胞骨架蛋白,在胶质母细胞瘤里驱动肿瘤的发生发展。也揭示了AVIL作为一个治疗靶点的潜在意义。在癌基因领域历尽大浪淘沙的时代居然还能发现功能如此明显的癌基因,意义非常重大。

  

胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的癌症之一,目前一直没有理想的治疗方法,倍受媒体关注的约翰•麦凯恩(John McCain)参议员,爱德华•肯尼迪(Edward Kennedy)参议员以及前副总统乔•拜登(Joe Biden)的儿子Beau Biden均已被确诊或死于这种疾病。当前的标准选择是手术后放疗联合替莫唑胺,而患者存活期也只能延长2个半月。因此,迫切需要更好地理解和识别新型肿瘤靶标。

美国弗吉尼亚大学医学院李辉实验室一直从事融合基因领域研究,在融合基因领域有很多重大发现。儿童癌症中的基因融合被列为“癌症登月计划”的十大重点领域之一,指出了基因融合的重要性以及迫切需要推进儿童癌症治疗。

除了推进儿童肿瘤领域外,有关儿童癌症的知识也可以扩展到成人癌症的研究,包括GBM在内的成年癌症带有复杂基因突变事件。不过儿童肿瘤有更清晰的基因组背景,特别是一些儿童肿瘤中的基因融合现象,考虑到基因融合通常会导致一种原癌基因的异常表达,因此研究人员从具有相对简单基因组的儿童肿瘤开始着手探索肿瘤的一些奥秘。这一课题是前期工作(横纹肌肉瘤融合基因)的延伸,扩展到成年胶质母细胞瘤GBM,研究人员意外发现了胶质母细胞瘤新靶标AVIL。

李辉团队的这一成果:“A cytoskeleton regulator AVIL drives tumorigenesis in glioblastoma”公布在Nature Communications杂志上。该团队发现了AVIL(一种多功能肌动蛋白调节基因)可驱动胶质母细胞瘤的肿瘤发生。

这是他们前期工作(2016 Xie et.al, PNAS)的延续,在横纹肌肉瘤细胞系RNA测序发现MARS/AVIL融合基因, GTEx数据显示MARS在各个正常组织中表达都高,属于管家基因,而AVIL只在骨骼肌和脑组织特异表达。于是探测MARS/AVIL是否也存在于脑瘤但最后没找到。

肿瘤是很复杂的,一些驱动癌基因通常隐藏得很深,也许在脑瘤中是另一种潜伏?山穷水复疑无路,柳暗花明又一村。研究团队从TCGA数据库分析得知AVIL在GBM患者中扩增比例达15-18%,考虑到染色体12q13-15区在多种肿瘤包括脑瘤中普遍扩增,AVIL位于人染色体12q13,距离CDK4着丝粒45 kb,而距离MDM2端粒约10 MB。而CDK4和MDM2在肿瘤发生发展中又具备重要功能,AVIL扩增也许只是这大区扩增的副产物?

为了辨清这个疑虑,他们用荧光标记的DNA探针检测5种胶质瘤细胞系,发现只有2种细胞系有DNA扩增,其余3种和正常细胞都没扩增,用qPCR检测也没发现这3种肿瘤细胞和对照细胞的RNA水平差异,进而检测蛋白水平,发现所有肿瘤细胞系比对照都高。从而阐明了AVIL扩增不是12q13-15区的副产物,而是有转录后的调控机制。

之后,免疫组织化学分析进一步证实了GBM患者中AVIL蛋白的过表达。正常大脑皮层灰质的染色很低,并且很大程度上局限于锥体神经元的亚群。正常脑白质显示出最低的免疫反应性。测试的所有GBM患者均具有更强的信号,课题组进而在REMBRANDT 数据库发现AVIL RNA水平与脑瘤患者肿瘤恶性级别相关联,且呈显著性差异。Western Blot检测AVIL在GBM患者中几乎都高表达, 而对照很弱甚至检测不到。另外在分析TCGA低级别胶质瘤(LGG)数据库中,发现高AVIL组比低AVIL组总生存期短得多,与GBM患者的中位生存期相当。

课题组也分析了弥散性神经胶质瘤的RNA测序数据,比较了IDH突变,1p/19q联合缺失等不同分类的AVIL水平,发现AVIL是一个很理想的诊断分子。GBM比LGG具有更高的AVIL水平,野生型IDH1的LGG与GBM具有较高的AVIL水平。有了这些很有意义的临床数据后于是开展细胞实验。在肿瘤细胞模型中, AVIL分别在DNA扩增,转录水平,翻译水平呈现出与对照正常细胞明显的差异,抑制AVIL,体外和颅内实验都有抑制肿瘤细胞生长的能力。而且在所有肿瘤干细胞细胞系中AVIL都高表达,表型分析发现AVIL对于肿瘤干细胞的增值和自我更新至关重要。AVIL可以促进细胞迁移,采用了活细胞成像,细胞形态观察实验来考察AVIL的功能。用逆转录病毒载体构建稳定过表达AVIL的细胞株, 通过MTT、平板克隆和集落实验检测细胞增殖能力。过表达AVIL除了细胞集落表型明显,甚至在裸鼠皮下注射过表达AVIL的正常星型胶质细胞居然能形成肿瘤,其病理切片显示是恶性,但对照细胞不长肿瘤,这些实验结果说明AVIL是真正的癌基因。

在机理上,课题组分析了AVIL的功能结构域,用共聚焦,生化生理实验,结构域点突变等实验手段证明了AVIL调控F-肌动蛋白,AVIL通过调节F-肌动蛋白来调节细胞骨架,而破坏F-肌动蛋白结合的突变体在其致瘤能力方面存在缺陷。在分子机制上,运用GSEA和BART网站等生物信息学方法以及分子生物学验证,探讨了AVIL的致癌作用可能部分由FOXM1(巧合的是,第一作者的博士课题从事FOXM1研究, 2010Xie et.al,NAR)介导调控LIN28B/Let7/HMGA2, IGFBP1, IGFBP3, 信号通路中的LIN28B, HMGA2, IGFBP1,IGFBP3表达水平也与临床预后相关。

总之,该研究首次报道AVIL作为一个细胞骨架蛋白,在胶质母细胞瘤中驱动肿瘤的发生发展。也揭示了AVIL作为一个治疗靶点的潜在意义。在癌基因领域历尽大浪淘沙的时代居然还能发现功能明显的癌基因,意义非常重大。

李辉课题组以前一直未涉猎脑胶质瘤工作,很多的科学发现就是这样意外。崆峒访道至湘湖,万卷诗书看转愚。总之,这个工作很漂亮,从儿童肿瘤融合基因延伸到成年脑胶质瘤的探索。思路新颖,数据充分。正如其审稿人说的Reviewer2:This is a very interesting study with the potential to alter the landscape of glioma research;Reviewer3: The manuscript holds many interesting and potentially impactful findings to the glioblastoma field.

该课题受RO1 NCI CA240601, Stand Up To Cancer SU2C-AACR-IRG0409资助。该研究在弗吉尼亚大学医学院完成,第一作者谢仲秋博士, 通讯作者李辉博士本科毕业于中国科技大学化学物理专业,在美国凯斯西储大学攻读生物学博士学位,耶鲁大学博士后,目前在弗吉尼亚大学医学院病理系从事肿瘤研究,是融合基因领域的领军学者。

作者简介:

李辉教授,男,博士, 辽宁沈阳人。1993-1998, 中国科技大学物理化学本科;1998-2003, Case Western Reserve University, Howard Hughes Medical Institute 生物学博士;2003-2009, Yale  University  病理系 博士后;2009- 2015, University of Virgina病理系和癌症研究中心 助理教授;2015- 至今,University of Virgina病理系和癌症研究中心 副教授。主持NIH RO1等多项课题,获得过Stand Up To Cancer Innovator Award,AACR Scholar, St.Baldrick’s Schloar, V Scholarship, IVY Foundation 等多项大奖。在Science,  Cancer Discovery, Trends in Cancer, PNAS,PLOS Genetics, Nucleic Acids Research等杂志发表过多篇高水平文章。目前主要从事融合基因在肿瘤发生发展和早期诊断的分子机理研究,近年来李辉博士在RNA领域取得了重大突破,国内外媒体相继多次报道。

文章链接https://doi.org/10.1038/s41467-020-17279-1
A cytoskeleton regulator AVIL drives  tumorigenesis in glioblastoma

Xie Z, Janczyk PŁ, Zhang Y, Liu A, Shi X, Singh S, Facemire L, Kubow K, Li Z, Jia Y, Schafer D, Mandell JW, Abounader R, Li H.

Abstract:Glioblastoma is a deadly cancer, with no effective therapies. Better understanding and identification of selective targets are urgently needed. We found that advillin (AVIL) is overexpressed in all the glioblastomas we tested including glioblastoma stem/initiating cells, but hardly detectable in non-neoplastic astrocytes, neural stem cells or normal brain. Glioma patients with increased AVIL expression have a worse prognosis. Silencing AVIL nearly eradicated glioblastoma cells in culture, and dramatically inhibited in vivo xenografts in mice, but had no effect on normal control cells. Conversely, overexpressing AVIL promoted cell proliferation and migration, enabled fibroblasts to escape contact inhibition, and transformed immortalized astrocytes, supporting AVIL being a bona fide oncogene. We provide evidence that the tumorigenic effect of AVIL is partly mediated by FOXM1, which regulates LIN28B, whose expression also correlates with clinical prognosis. AVIL regulates the cytoskeleton through modulating F-actin, while mutants disrupting F-actin binding are defective in its tumorigenic capabilities.

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