从C到A，从单到双：碱基编辑器的演化之旅

人类的许多遗传病是由基因组中的突变引起的。因此，科学家在不断寻找工具去编辑或修复遗传代码中的这些错误。CRISPR/Cas9便成为最有希望的技术之一。利用这把“剪刀”，研究人员能够改变或删除某个基因。然而，CRISPR的应用也面临一个问题，那就是同源定向修复（HDR）的编辑效率太低。

为了应对这一问题，哈佛大学著名的David Liu实验室在2016年利用Cas9融合蛋白开发出单碱基编辑器，能够大大提高碱基编辑的效率。自此，研究人员不断开发碱基编辑工具，可在动物、植物和微生物中实现点突变。如今，碱基编辑已经广泛应用于基础研究、合成生物学和作物改良，引起了学术界和工业界的极大兴趣。

早期的碱基编辑器

David Liu实验室最初利用大鼠的胞苷脱氨酶APOBEC1和dCas9创建出第一代的碱基编辑器（BE1），能够将胞嘧啶（C）转化成尿嘧啶（U），从而实现C→T（或G→A）的碱基替换¹。BE1表现出约5个核苷酸的活性窗口，从第4位到第8位。不过，在转移到细胞培养模型之后，他们发现编辑效率从44%陡降至0.8-7.7%，这可能是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）参与了碱基切除修复，去除了DNA中的尿嘧啶。

于是，他们就开发出第二代的BE2系统，将尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）与dCas9相融合，从而将编辑效率提高了三倍，最高达到20%。对于BE1和BE2，由于DNA并非直接切割，因此插入缺失的形成非常少（< 0.1%）。

为了让碱基编辑的效率提高到50%以上，你需要将编辑复制到另一条DNA链上。为此，研究人员将dCas9变身为切口酶，以便模拟错配修复。BE3在未修饰的DNA链上产生切口，使它看起来像是新合成的。因此，细胞以含有尿嘧啶的链作为模板来修复DNA，并复制碱基编辑。

胞嘧啶碱基编辑器的示意图（图片来自Addgene）

通过这种方式，BE3系统将各种靶点的编辑效率提高到30%以上，且插入缺失的频率仅为1.1%。这与Cas9介导的HDR相比是巨大的进步，因为HDR介导的编辑效率仅为0.5%，而且观察到多个插入缺失。不过，此系统也会带来脱靶效应，主要来自Cas9脱靶，而不是APOBEC1。

第三代编辑器的改进

日本神户大学Akihiko Kondo领导的团队随后进一步证实了碱基编辑的实用性²。他们将来自海鳗的胞苷脱氨酶与Cas9切口酶相融合，创建了Target-AID碱基编辑器。它的作用方式与BE3类似，但又不完全相同，其编辑窗口位于PAM上游18个碱基处的3-5个碱基。

David Liu实验室在2017年也生成了带有其他脱氨酶的BE3变体，包括AID、CDA1和APOBEC3G。他们发现，CDA1-BE3和AID-BE3能够比BE3更有效地编辑G后面的C，而APOBEC3G表现出较少的序列偏好。这些结果表明，特定的脱氨酶以及与Cas9的连接方式会影响编辑的作用和效率³。

之后，David Liu实验室的研究人员将重点又放在Cas9上。他们利用天然和改造的Cas9变体开发出五种PAM序列不同的碱基编辑器，从而扩大了碱基编辑的目标范围⁴。对于每种碱基编辑器，他们观察到的最低编辑效率约为50%，并确认融合蛋白保留了Cas9的PAM特性。他们还诱变了碱基编辑器的胞苷脱氨酶部分，产生了SpCas9碱基编辑器，其编辑窗口小到只有1-2个核苷酸。

为了减少与碱基编辑相关的脱靶效应，研究人员又建立了高保真版的BE3系统⁵，这个碱基编辑器采用了高保真的Cas9变体——HF-Cas9。随后，他们利用容易脱靶的gRNA来测试原始的BE3和HF-BE3。他们发现，HF-BE3的脱靶编辑比BE3低了37倍。为了进一步提高特异性，他们纯化了HF-BE3蛋白，并以核糖核蛋白颗粒（RNP）形式导入斑马鱼胚胎和小鼠内耳。

第四代的碱基编辑器

研究人员观察到，以BE3为基础的系统不仅仅会产生C→T，还会产生C→G或C→A。他们假设，这些副产物是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）切除尿嘧啶而产生的。于是，David Liu实验室在BE3的基础上，融合了第二个拷贝的UNG抑制剂，以提高碱基编辑产物的纯度。自此，第四代碱基剪辑器BE4产生。与BE3相比，BE4的C→G和C→A产物减少了2.3倍³。

为了进一步降低插入缺失的产生，David Liu领导的研究团队将噬菌体蛋白Gam融合到BE4的N端。Gam蛋白与双链断裂的游离端结合，可能导致细胞死亡，而不是NHEJ修复，从而将修复细胞从编辑细胞中剔除。因此，Gam与BE4或SaBE4的融合使得插入缺失的频率降低1.5-2倍。

腺嘌呤碱基编辑器

以往的碱基编辑大多限于C→T的转换，或另一条链上G→A的转换。是否能够对其他碱基进行编辑？还是David Liu实验室，他们在2017年开发出一个腺嘌呤碱基编辑器，将腺嘌呤转化成肌苷，从而实现A→G的转换。由于没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶，他们便通过定向进化从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中产生。

经过七轮的分子进化，研究人员获得了四种腺嘌呤碱基编辑器（ABE）⁶。ABE7.10是活性最高的编辑器，在目标位置4-7的编辑窗口内显示出平均53%的编辑效率。ABE 6.3、7.8和7.9则显示出较宽的编辑窗口。与CBE不同，ABE不会在目标位点处出现A到其他碱基的转换。他们认为从DNA中去除肌苷的可能性比较小，从而阻止了碱基切除修复。

改进改进再改进

当然，任何碱基编辑器都不是完美的，于是研究人员开启了漫长的改造之旅。2018年，David Liu实验室在《Nature Biotechnology》杂志上发表文章，显示表达水平是碱基编辑效率的一个瓶颈。他们通过修饰核定位信号（NLS）和密码子使用以及脱氨酶组分的重构来优化胞嘧啶（BE4）和腺嘌呤（ABE7.10）碱基编辑器。此次产生的BE4max、AncBE4max和ABEmax编辑器可以在各种类型的哺乳动物细胞中纠正致病性SNP，并大大提高效率⁷。

在碱基编辑这一领域，中国学者也发表了大量成果。2018年，中科院遗传与发育所的研究人员在前期研究基础上利用Cas9变体（nCas9-D10A）融合人类胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A（A3A）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成新的单碱基编辑系统A3A-PBE，成功在小麦、水稻及马铃薯等植物中实现比PBE更加高效的C→T单碱基编辑⁸。

不久前，华东师范大学的李大力和刘明耀课题组在《Nature Biotechnology》杂志发表了一种全新的双碱基编辑器。他们将人类胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和Cas9切口酶融合在一起，开发了腺嘌呤和胞嘧啶的双碱基编辑器A&C-BEmax，它可以在同一等位基因的靶序列上实现C→T和A→G的高效转换⁹。

至于双碱基编辑器，同期《Nature Biotechnology》杂志上还发表了麻省总医院的另一项成果。J. Keith Joung 团队将腺苷脱氨酶（TadA）、来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶（PmCDA1），分别融合到Cas9切口酶的N端和C端，开发出一种双碱基编辑工具SPACE（Synchronous Programmable Adenine and Cytosine Editor），可以同时引入A→G和C→T替代¹⁰。

参考文献

1. Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). https://doi.org/10.1038/nature17946
2. Nishida, Keiji, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science 16 Sep 2016: Vol. 353, Issue 6305, aaf8729 DOI: 10.1126/science.aaf8729
3. Komor, Alexis C., et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances 30 Aug 2017: Vol. 3, no. 8, eaao4774 DOI: 10.1126/sciadv.aao4774
4. Kim, Y., Komor, A., Levy, J. et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat Biotechnol 35, 371–376 (2017). https://doi.org/10.1038/nbt.3803
5. Rees, H., Komor, A., Yeh, W. et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nat Commun 8, 15790 (2017). https://doi.org/10.1038/ncomms15790
6. Gaudelli, N., Komor, A., Rees, H. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017). https://doi.org/10.1038/nature24644
7. Koblan, L., Doman, J., Wilson, C. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol 36, 843–846 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4172
8. Zong, Y., Song, Q., Li, C. et al. Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A. Nat Biotechnol 36, 950–953 (2018). https://doi.org/10.1038/nbt.4261
9. Zhang, X., Zhu, B., Chen, L. et al. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nat Biotechnol 38, 856–860 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0527-y
10. Grünewald, J., Zhou, R., Lareau, C.A. et al. A dual-deaminase CRISPR base editor enables concurrent adenine and cytosine editing. Nat Biotechnol 38, 861–864 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0535-y