生物通 | 新技术专栏

单细胞RNA测序,众多研究都pick它

【字体: 时间:2020年08月24日 来源:生物通

编辑推荐:

  多细胞测序和单细胞测序,你pick谁?如今,大多数研究人员也许会选择后者,因为不一样的角度,会带来不一样的见解。

多细胞测序和单细胞测序,你pick谁?如今,大多数研究人员也许会选择后者,因为不一样的角度,会带来不一样的见解。单细胞测序的最初动力来自癌症研究,可帮助人们了解肿瘤异质性和肿瘤微环境。它还有助于我们了解其他的复杂生物系统,比如中枢神经系统和免疫系统。

如今,单细胞分选工具和建库技术的成熟,以及新一代测序技术的普及,让人们能够高通量地开展单细胞RNA测序(scRNA-seq)。考虑到单细胞实验通常缺乏空间关系,新的方法和算法也将单细胞基因表达的测定与组织内的空间定位结合起来。

优点与缺点

当然,正如每个硬币都有两面,单细胞RNA测序也有优点和缺点。它的主要优势之一在于能够发现未知的东西。不过,这种神奇视角也伴随着一些缺陷,比如缺乏灵敏度。

在使用传统的RNA测序时,研究人员通常会采用大块的样本,由多个细胞组成。因此,RNA-seq的灵敏度比scRNA-seq更高。加州大学圣地亚哥分校的Miles Wilkinson教授指出,将RNA-seq应用于大量细胞样本时,科学家可以检测到极低水平的基因表达,以及与化疗或敲除相对应的基因表达变化。

“相反,单细胞RNA-seq往往只能识别基因组中一小部分表达的基因,”他补充说。“它通常无法检测到基因表达中的细微变化。为了达到统计显著性,至少需要两倍或三倍的变化。”

这并不是scRNA-seq的唯一挑战。Fluidigm的RNA-seq产品管理总监Steve Kain介绍,其他需要考虑的因素包括成本和复杂性。“人们必须检测大量单细胞,才能获得统计学上有意义的结果,”他说。“通常,这会增加文库制备和测序的成本。不过微流体方法可将此类成本降至最低。”

尽管存在一些缺点,但scRNA-seq绝对是值得期待的。想象一下,用药物处理组织后,对大量细胞进行分析,发现某种RNA增加了100倍。“你其实并不清楚究竟是组织中的每个细胞以相同方式应答,还是少数细胞中的RNA增加了1,000倍,”Kain解释说。scRNA-seq带来了一个机会,让您能够更深入地了解哪些细胞产生了应答。它能揭示组织或器官中每种细胞的转录状态,而不是提供所谓的“平均值”。

样本制备

首先,你需要从样本中获得单个细胞。尽管某些样本可以采用荧光激活细胞分选(FACS)技术,但有些组织却面临着更大的挑战。Invent Biotechnologies公司的首席技术官Q. Lee表示:“人们很难在不损伤细胞的前提下,从大脑、脂肪和心脏等组织中分离出单个细胞。”

“另外一个问题是,大多数的临床样本都是冷冻的,很难从冷冻组织中分离出完整的细胞,”Lee说。目前,Invent Biotechnologies开发出几款试剂盒,能够更轻松地从冷冻组织中分离出细胞核,比如说适用于新鲜/冷冻组织的Minute™ Cell Suspension Isolation Kit。

研究人员不仅可使用单细胞,也可以使用单细胞核。之前的研究证明,核转录组和全细胞转录组在细胞类型标志物的表达上具有高度的一致性。Invent Biotechnologies也提供了几种试剂盒,能够很方便地从各种新鲜/冷冻组织中分离细胞核,包括脂肪组织、神经组织/细胞以及普通组织/细胞。

研究人员也可以考虑其他方法,比如Fluidigm的微流体技术。它家的C1单细胞mRNA测序流程能够自动处理数百个单细胞,轻松鉴定组织中的细胞组成,并比较样本中特定细胞的丰度。据Kain介绍,C1还支持单细胞的多组学分析,这使得人们能够从每个细胞中获得更多信息。

同时,他们也可以采用不同的方法收集所需的细胞。“激光捕获显微切割技术的进步可以大大提高scRNA-seq的效率和质量,”Kain谈道。“Fluidigm AccuLift激光捕获显微切割系统之类的新技术确保了极其精确的靶向,既可以实现温和的单细胞捕获,又可以有效地切割较大的组织区域,同时保留生物分子的完整性。”

一些平台还能够实现高通量。例如,Wilkinson教授举例说,10x Genomics的技术可处理更多的细胞,并且是一台相当简单的机器。10x Genomics的Chromium Controller是基于微流控技术的单细胞文库制备系统,能够高效地生成100-80,000个单细胞,制备出的文库和Illumina平台兼容。

发育和疾病

单细胞中的RNA变化让科学家和医生能够更深入地了解疾病。麦吉尔大学的神经外科医生Kevin Petrecca表示:“我们利用scRNA-seq来鉴定胶质母细胞瘤和正常大脑中各类细胞的转录组。”他认为,单细胞图谱分析的优势在于,它能够全面地了解肿瘤内存在的不同类型癌细胞,以及这些癌细胞与正常细胞的相似程度。

例如,Petrecca及其同事采用scRNA-seq来分析53,586个胶质母细胞瘤细胞和22,637个正常脑细胞。他们报告称:“这项分析表明,正常大脑发育与胶质母细胞瘤的发育一致,这暗示了肿瘤层次结构的可能来源,并有助于确定癌症干细胞特异性的靶点。”这类信息对侵袭性癌症特别有用1

这张图片显示了一名患者的癌细胞分化过程,祖细胞(黑色)发育成少突胶质细胞(紫色)、星形胶质细胞(红色)和间充质细胞(绿色)。这些数据证明了癌症层次结构中谱系分化的连续性。图片来源:Kevin Petrecca。

上游和下游

许多单细胞分析的材料都是无比珍贵的临床样本。珍惜临床样本,要从样本处理开始。如果你对此过程不熟悉,欢迎索取10x Genomics的《单细胞基因表达样本制备指南》>> ,了解如何解离细胞以及如何清洗和过滤细胞。在枪头选择上,它也提供了一些建议。

一旦你收集了所需的细胞并对它们进行测序,下游就必须对数据进行分析。Wilkinson 表示:“对于生物信息学经验丰富的实验室而言,当前的分析流程非常友好。不过若实验室没什么数据分析经验,我建议与别人合作。”

总而言之,单细胞RNA测序提供了其他方法无法获得的许多信息。不过,这种方法也存在挑战,包括解离细胞的挑战以及数据分析的挑战。如果无法分离出健康的单细胞,则可以用单细胞核来代替单细胞。市场上的许多新产品也许能大大减轻你的负担。

参考文献

1. Couturier, C.P., Ayyadhury, S., Le, P.U. et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nat Commun 11, 3406 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-17186-5

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号