路明克斯Amnis量化成像流式细胞仪在细胞治疗研究中的应用

利用传统流式细胞仪检测技术，研究人员可以分析成千上万个细胞，获得每个细胞的散射光信号和荧光信号，从而得到细胞群体的各种统计数据。但是传统流式细胞检测技术获得的细胞信息相对有限。细胞对研究人员来说，只是散点图上的一个点，而不是真实的细胞图像，缺乏细胞形态学、细胞结构及亚细胞水平信号分布的相关信息。要想获得细胞图像，研究人员就必须使用显微镜进行观察，但显微镜能够观察的细胞数量是非常有限的，很难提供细胞群体的量化与统计数据。路明克斯Amnis量化成像技术开创性地将流式细胞技术与荧光显微成像技术结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。

路明克斯Amnis量化成像流式细胞仪具有高达12个检测通道，可以对通过流动室中的每个细胞进行成像，并对图像进行多参数量化分析，获得全新的细胞形态统计学数据。系统配有功能强大的数据分析软件IDEAS，可以对每个细胞图像通道分析超过上百种量化参数。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，还包括对细胞形态，荧光分布、小点计数、荧光共定位等多种信息的分析。随着Amnis高速显微成像流式细胞技术的发展成熟，越来越多的科研人员开始将这种革命性的技术手段运用到自身的研究领域，并发表了大量有影响力的论文。

图1.路明克斯Amnis量化成像流式细胞仪，左为FlowSight，右为ImageStream MK II

近年来肿瘤的免疫治疗取得了巨大的进步，尤其是嵌合体抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)技术在治疗白血病、神经胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤等恶性肿瘤中取得了较大的成果。CAR-T技术治疗肿瘤的步骤包括提取患者T细胞，进行体外基因转染操作将肿瘤相关抗原的单链抗体表达于T细胞膜表面，在体外扩增CAR-T 细胞，并回输CAR-T细胞到患者体内对肿瘤进行杀伤，如图2所示。

图2. 嵌合体抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)技术原理

利用Amnis成像流式细胞仪可以观察免疫细胞对于肿瘤细胞的杀伤机制，如在NK细胞靶向杀伤小鼠B细胞淋巴瘤的研究中，NK细胞用DiO染料染色标记成绿色，肿瘤细胞磷脂酰丝氨酸外翻用Annexin V-APC染色成红色，NK细胞靶向淋巴瘤细胞以后，可诱导肿瘤细胞的凋亡，如图3所示。Brightfield通道显示NK细胞靶向到B淋巴瘤细胞以后所形成的二聚体细胞，NK cell通道为绿色的NK细胞，DAPI通道显示B淋巴瘤细胞的细胞核，Anx V通道为B淋巴瘤细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸外翻的凋亡标记，Composite为各荧光通道的图像信息叠加。

图3. 利用Amnis成像流式细胞仪研究NK细胞靶向肿瘤细胞引起细胞凋亡

来自耶鲁大学的Patrick等科学家则将这一技术更加推动一步，十分巧妙的设计和合成了模拟抗体类似特性的化合物SyAM-P，该化合物一端可以结合到前列腺癌细胞表面抗原PSMA，一端结合免疫细胞表面FcγRI，通过这种方式可以使免疫细胞靶向杀伤前列腺癌细胞，如图4所示。

图4. 抗体特性模拟化合物

当SyAM-P引导单核细胞靶向前列腺癌细胞后，单核细胞通过吞噬效应进行前列腺癌细胞的杀伤。与传统流式不同的是，Amnis可以结合图像清晰的观察到效应免疫细胞对肿瘤细胞的吞噬过程，如图5所示。其中Target为绿色荧光标记的前列腺癌细胞，Effector为红色荧光标记的单核细胞，图5上方是单核细胞已经完成对前列腺癌细胞吞噬后的细胞图像，可见绿色的前列腺癌细胞位于单核细胞内部，而图5下方则是单核细胞正在进行吞噬过程的细胞图像，可见单核细胞与前列腺癌细胞之间吞噬杯的形成。

图5. 在SyAM-P的作用下，单核细胞对前列腺癌细胞进行吞噬，上图为吞噬完成后，下图为吞噬过程中吞噬杯的形成

在另一项研究中，来自美国Medimmune公司的M Jack Borrok等科学家发现赋予人表皮生长因子Her2-IgG1 FcαRI 以提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。他们利用成像流式Amnis观察到Celltrace Violet（活细胞紫色荧光染料）标记的巨噬细胞对CFSE （活细胞绿色荧光染料）标记的乳腺癌靶细胞进行吞噬的过程，并对吞噬比例进行统计。如图6所示，在散点图中可以看见，1为紫色荧光标记的单个吞噬细胞，2为早期吞噬过程中的巨噬细胞和乳腺癌靶细胞，3为吞噬完成的巨噬细胞和乳腺癌靶细胞，4为绿色荧光标记的巨噬细胞。通过成像流式细胞仪Amnis的分析，可以很好的评价改造后抗体对提升吞噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。

图6. 利用成像流式Amnis评价抗体改造前后吞噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力

利用成像流式Amnis让科学研究更加生动，富有乐趣，流式细胞仪的快速灵敏和成像分析的大数据则让文章充满亮点，让成像流式Amnis成为您的好帮手。