最大化利用测序资源，这些小技巧掌握了没有？

新一代测序（NGS）技术自2005年出现以来，正在大大推动科研、转化和临床研究的发展。利用测序所获得的信息，我们正在发现癌症和遗传病的诊疗线索，探索生物体发育的秘密，并揭示复杂的微生物种群。以往遥不可及的高通量测序仪，如今已飞入寻常实验室。

尽管新一代测序的流程复杂、成本高昂，但您还是有很多机会来提高效率、优化步骤并提高数据质量。本文提供了一些小技巧，可以帮助您避开陷阱，以免得到低质量的文库和信息不足的序列。这里还有一些策略可帮您节省测序资源。

您需要什么样的测序深度？

这个问题在一开始就要考虑好。回答不同的研究问题，可能需要不同的测序覆盖深度，也就是每个碱基被测序的平均次数。在鉴定生殖系突变、插入缺失和重排时，20倍或更低的深度也许就够了。鉴定体细胞突变或低频的SNP则可能需要至少100倍的覆盖深度，而一些医学研究需要更深的覆盖度。

为了避免测序资源的浪费，建议在第一次测序运行时就达到您所需的覆盖深度；否则，您必须重复流程中的某些步骤，无论是靶向富集、文库制备还是测序，都会不可避免地增加实验成本。不过话说回来，如果只需要20倍的覆盖深度，那么就没有必要进行更深度测序。

评估起始DNA的质量和数量

避免浪费时间和资源的另一种方法是评估起始DNA的质量和数量。基于qPCR的定量方法比较准确，因为它们仅检测DNA分子，而且还能提供有关大小分布的信息。对比qPCR方法，其他方法容易低估或者高估文库浓度。起始DNA的准确评估有助于提高文库产量，降低重复率，改善序列覆盖度，并保留文库的多样性。在研究受损或降解样本（比如FFPE）时，这显得尤为重要。

更重要的是，起始量的准确QC能够优化文库制备的流程，最大程度地提高可转化为文库分子的起始量。准确估计有多少DNA能进入文库制备，这也有助于计算每个样本可以获得的理论覆盖深度。举个例子，如果最终文库含有的基因组少于理论上所需的，那么就无法达到所需的覆盖深度。对于一些质量并非最优秀的样本，这一点尤其重要，可避免昂贵的再次测序。

使用高质量的文库制备试剂

在文库制备时，您需要了解建库产品与哪些类型的起始材料兼容，比如FFPE样本、低质量DNA、低起始量DNA或者cfDNA；转换率如何，也就是成功连接测序接头的起始DNA分子的比例；以及是否保留了起始样本的复杂性。

另外，特别是在靶向富集流程中，您还需要考虑GC偏倚以及覆盖均一性。若存在GC偏倚，则某些区域的覆盖度可能极低（需要再次测序），而某些区域又过度测序（导致reads浪费）。在有些情况下，某些目标区域可能完全丢失，这被称为目标dropout。

若不幸发生这种情况，则必须重建构建靶向富集文库，因为再次测序也无法提供这些区域的数据。建议您选择可靠的生产商，使用精心设计的靶向富集探针，以避免这些问题的出现。此外，高质量的探针还能缩短杂交时间，加快整个流程并增加样本通量，而不会影响数据质量。

选择合适的多重分析方案

将多个样本合并在一起开展多重分析，能够增加靶向富集捕获反应中的样本量或单次测序运行中的样本量，节省时间和试剂，并降低测序成本。在靶向富集流程中，样本可在捕获前合并，也可在捕获后合并。对于这两种情况，您都需要确保每个文库所用的接头与多重分析方案兼容。

pre-capture多重分析方案是在杂交步骤之前合并样本。这种方案需要的捕获试剂较少，需要的处理也较少，让操作失误的可能性降低。post-capture多重分析方案则是在测序之前合并文库。它降低了测序成本，也保留了再次运行特定样本的可能性。若某些样本需要较高或较低的测序深度，则可以调整文库的相对浓度。

在测序前准确定量文库

通过qPCR方法来定量文库，能够在测序流动槽上实现最佳的成簇效果。相反，如果采用荧光方法或电泳方法进行定量，则可能会检测到无法测序的分子，如缺乏p5或p7接头的分子，或者无法定量所有可测序的分子，如单链文库分子。若文库定量不够准确，则可能导致流动槽上的成簇不足，浪费测序资源，或者成簇过度，导致某些reads无法使用。

多个厂家都提供了可靠的文库制备产品，比如罗氏。他家第三代的文库制备试剂盒KAPA HyperPlus极大简化了工作流程，文库片段化和文库制备全部可在单管中操作完成。KAPA HyperPlus试剂盒融合了行业领先的文库构建效率和非凡的文库质量，添加了酶切片段化模块，使得工作流程更加方便、快捷。