新的自噬标志物 pATG16L1s278 - 自噬研究的利器

细胞自噬机制与癌症/老年相关疾病疗法的研究越来越受关注，但常用自噬检测标记物所存在的局限性一直令人困扰。新发现的自噬标志物相比一直广泛使用的标志物p62和LC3B，突破了原有局限不受干扰，更独立实时专一地反映自噬诱导发生，有望成为新的替代。来了解一下这个新的自噬研究利器到底好在哪里？

　　

    细胞自噬是细胞清除“垃圾”、更新细胞器的自我调节机制之一。2016 年诺贝尔生理学/医学奖就授予了揭开细胞自噬机制的日本科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）。自噬的异常或损伤（失调）会对细胞和机体健康造成严重的后果，被认为与多种老年相关疾病和癌症相关。寻找能在各种疾病中靶向自噬作用的相关药物目前已成为研究热点。

通过本篇阅读，您可以了解自噬研究的困难及科学家如何利用新的自噬标志物破局。

自噬研究之困
    自噬在正常情况下并不活跃，研究常用的方法是诱导性自噬——比如饥饿、药物、或者用遗传手段修饰自噬相关基因，分析检测对应的细胞自噬现象，探讨其对自噬过程的影响和结果。但也存在许多技术挑战：很难检测和准确量化自噬速率、进而分析自噬诱导和自噬进程。

    目前最常用的自噬标志物是LC3B和P62，但存在某些局限。LC3B属于LC3/GABARAP家族，参与吞噬和自噬体闭合，LC3B-II（脂化LC3B）的增加提示自噬率升高，但是检测LC3B-II要防止假象干扰——它始终保留在成熟的自噬体中，当后期清除自噬体出现阻滞而造成待周转自噬体积累时会造成LC3B-II水平居高不下的假象，容易被错误当做自噬率升高；而在某些应激条件下LC3B-II快速降解又会部分掩盖自噬率增加。因此，使用LC3B-II进行自噬率分析通常需要在增加自噬体清除抑制剂的情况下进行。然而，这类药在活体使用可能有问题，体外的长时间应激使用和晚期自噬阻滞也可能造成结果成谜。

    自噬配体p62蛋白也是常用于评估自噬的标志物。p62可响应多种刺激参与自噬、作为自噬配体与LC3B相互作用、负责招募特定“待降解货物”到自噬体膜上，迅速与“货物”一起被降解。然而，使用p62进行自噬分析也要特别注意：1）p62的转录受应激源和疾病状态的调控，对蛋白质水平的影响是独立于自噬流的；2）不同的应激源或可优先利用某些特定的自噬配体，如果分析前不确定配体可能会造成问题；3）在长时间持续刺激下，p62水平在初期下降后保持降低，对延长刺激的自噬率变化难以提供有用信息。

新的自噬标志物 突破局限
    自噬研究越来越受重视，突破检测的局限性、寻找更好的检测目标是越来越迫切的需求。理想的检测目标就应该是跟自噬体生成本身关联的、各种应激自噬启动都必需的蛋白，对自噬体周转阻断导致的自噬体累积不敏感、对自噬激活持续时间的影响不敏感。

    Abcam与加拿大渥太华大学的自噬研究小组密切合作，从已知40多种高度保守的自噬相关蛋白ATG中筛选并发现一个新的自噬标志物——ATG16L1，这靶点看起来很理想——
1.几乎所有条件下启动自噬都必须经过ULK激酶将ATG16L1上一个保守的丝氨酸(S278)位点磷酸化。
2.ATG16L1的丝氨酸(S278)位点磷酸化仅与新自噬体形成有关，使用抗体测量磷酸化的 ATG16L1 蛋白水平直接对应于自噬速率；
3.ATG16L1不同于LC3/GABARAP或者p62自噬配体那样有多种成员来应对不同刺激，其磷酸化是自噬诱导过程中应激的一个通用信号事件——无论刺激和降解底物是啥。

    于是Abcam团队与加拿大研究人员共同开发了一个能检测内源性ATG16L1上丝氨酸（278位）磷酸化的单克隆抗体( pATG16L1^s278)。跨越三大洲的研究人员紧密合作，从多个角度分析了这个抗体在检测诱导性自噬的特异性、多种应用的适用性、与原有标志物比较的优越性，研究在nature method（IF: 28）上发表（PMID: 31768061）。

1.有效性与特异性
    pATG16L1^s278抗体Western Blot能有效检测出野生型细胞响应氨基酸饥饿刺激而产生的自噬信号，ATG16L1敲除(KO)细胞、S278位点突变、关键自噬基因的缺失或用药物阻断自噬，均可阻断ATG16L1磷酸化而检测不到信号，证实了该抗体具特异性。

    实验表明，不仅限于感染和缺乏氨基酸诱导，其他诱导自噬的压力因素如mTOR抑制、葡萄糖缺乏、细胞因子耗尽、活性氧、线粒体解耦条件下用pATG16L1^s278均能检测到ATG16L1磷酸化水平增加，再通过现有的检测LC3B-II增加和p62清除的两种方法验证，证实pATG16L1^s278检测结果的提高与自噬诱导相关。

    该抗体是由 ATG16L1的一个高度保守的区域产生，能够检测到来源于不同物种和组织的8种细胞系中ATG16L1的磷酸化。

2.适用于WB、免疫荧光检测、组织学切片
    在pATG16L1^s278免疫荧光实验中从多个角度证实了该抗体用于免疫荧光分析并具特异性。值得一提的是，pATG16L1^s278抗体在野生型细胞中基本与总ATG16L1抗体共定位表明它与自噬体高度选择性相关，且结果几乎完全是点状图，明显优于总ATG16L1抗体的弥漫性+点状信号结果。

    冰冻切片和石蜡切片结果也一样出色。用pATG16L1^s278检测饥饿小鼠（饥饿处理16小时）和对照小鼠（随意喂食）的肌肉冰冻切片，可观察到饥饿小鼠肌肉样本中每个细胞的斑点显著增加，表明用pATG16L1^s278抗体进行免疫组化(IHC)可检测到诱导作用。同样条件下LC3B染色在饥饿样本中虽有增加，但未达到统计学意义。FFPE样本实验同样证实pATG16L1^s278适用于IHC自噬分析。

3.较之已有自噬标记物，新标志物抗体更佳。
    研究人员分析了饥饿诱导下pATG16L1^s278与两种常用标记物的共定位。共染色结果显示：诱导自噬条件下pATG16L1^s278与两种标志物的斑点有部分共定位，但p62和LC3B之间的共定位程度高于pATG16L1^s278。由于p62和LC3B仍保留在完全成熟的自噬体上，pATG16L1^s278选择性定位于新形成的自噬体，因此ATG16L1^s278可能在自噬体闭合前与自噬体膜相关，能为自噬起始的速率提供一个直观读数。用溶酶体标记物LAMP1抗体与pATG16L1^s278共染色自噬溶酶体，发现很少pATG16L1^s278定位于自噬溶酶体，提示ATG16L1^s278可能在起始阶段定位于新形成的自噬体，在自噬体成熟时与WIPI蛋白一起解离。pATG16L1^s278应该对自噬体清除的阻断不敏感。

    自噬研究中一直存在一个困扰：自噬体周转的阻断导致LC3B阳性囊泡的积累这一现象很难与诱导性自噬进行区分。pATG16L1^s278蛋白水平变化是否受成熟自噬体积累的影响？研究人员在营养充足条件下用抑制自噬体周转的Baf A1处理细胞，结果发现：尽管营养充足条件下总体自噬速率没有增加，但LC3B斑点显著增加；而pATG16L1^s278则没有明显变化，这与在营养充足条件下自噬诱导率不增加是一致的。pATG16L1^s278的Western Blot的检测同样表明自噬率没有增加。因此可见，pATG16L1^s278可以区分自噬诱导和自噬体积累。

    将现有自噬流标记物与pATG16L1^s278 诱导动力学进行比较，用蛋白印迹法来检测饥饿刺激叠加使用自噬抑制剂的条件下LC3B-II和pATG16L1水平，结果显示LC3B-II和pATG16L1的峰值信号之间具有稳定的相关性，表明ATG16L1磷酸化分析可以作为LC3B-II分析自噬流抑制的一种替代分析。

    在没有Baf A1的情况下进行自噬诱导，检测p62清除可以观察到p62蛋白水平显著下降，同时ATG16L1磷酸化水平增加。然而这两种方法在早期和晚期提供的信息略有不同。饥饿40min后，可观察到pATG16L1^s278显著增加而p62水平轻微下降，这与在自噬流早期点“一些新的自噬体正在形成（pATG16L1^s278高）但只有少数自噬体与溶酶体融合降解p62”是吻合的。然而，超过120min的饥饿处理，p62水平仍然很低，这使得在自噬配体清除开始后很难以此确定自噬流的变化。在3- 4h左右能检测到pATG16L1^s278和LC3B-II水平的增加，但用p62清除法则无法检测到。此外，有报道说应激诱导的p62降解与p62转录上调是相关联的。相比之下，由于磷酸化/去磷酸化是快速和可逆的，使pATG16L1^s278成为检测自噬活性的理想指标。通过磷酸化ATG16L1来分析自噬的另一个独特优势在于：对饥饿持续时间不敏感。

    研究人员还用LC3B荧光报告基因系、内源性pATG16L1^s278染色、和一种自噬体特异的活细胞染色剂Cyto-ID，分析了在pATG16L1^s278达到峰值的时间点上自噬体的形成，证实了自噬体的形成与pATG16L1^s278水平相关。使用电镜和Western Blot分析证实了饥饿条件下的pATG16L1^s278的增加与自噬囊泡的增加相关联。
该抗体有可能成为测量哺乳动物系统自噬的新标准，有望更好地支持全球研究人员对这一关键细胞过程及其对疾病影响的深入研究和理解。

结束语
    Abcam与加拿大渥太华大学研究人员合作推出的首个单克隆抗体pATG16L1^s278可作为检测自噬率的稳健指标，适用于内源性检测多种组织和物种的诱导性自噬，它独立于晚期自噬阻滞，有可能比广泛使用的标记物如p62和LC3B提供更准确的自噬诱导读数，并可能有助于分析自噬体膜扩展延伸的机制和阶段。目前尚未发现，单独pATG16L1^s278的使用是否会在某些特定情况下产生误导。尽管目前来说，多种自噬分析方法的联合使用仍然是研究自噬途径的最佳途径。但是pATG16L1^s278抗体的推出仍可能成为自噬研究的新工具，从而加快自噬研究的步伐。点击获取详情（ATG16L1重组抗体[EPR19016]_ATG16L1抗体(ab195242)| Abcam中文官网）