PacBio HiFi测序强势助力SARS-CoV-2新冠病毒的追踪和溯源

　　

自2019年底起，不明来源的新冠病毒在全国乃至全球迅速蔓延和传播，对我们每一个人的生活和工作造成了深刻的影响。然而，新冠病毒究竟源自何处？如何传播？如何突变、演化？这些问题仍然是全球科学家亟待解决的难题。

2020年4月份开始，PacBio联合LabCorp公司帮助美国CDC实现全国范围内的SARS-CoV-2大规模病毒基因组完整测序，利用长读长高准确度测序技术来实现对新冠病毒的检测和溯源，尤其是病毒变异的检测。

Part 1 样本收集

LabCorp作为一家先进的诊断检测公司，在美国全国范围内设有多个采集点，并且提供PIXEL样品收集试剂盒让群众在家就可以自己收集样品，一方面减轻检测中心的工作压力，另一方面也可以大大提高全国的覆盖范围。同时利用实验室信息管理系统LIMS来管理样品，包括采集时间、地点、患者年龄、性别等所有相关信息，每一步检测结果，如核酸浓度、RT-PCR结果等，可以关联样本信息并进行深入分析研究。

下图中展示了样本在全国的覆盖率，随着时间的推移，每一个邮政编码中都对应唯一的阳性样本数量，圆圈的大小和颜色表示每个邮编中样本的数量。左图展示的是样本总数的累计。右图则展示的是当样本出现在样本库中两周之后被删除，从而更加体现大流行病的实时状态，假设患者在两周之后康复或者被隔离治疗不再传播病毒。LabCorp已经拥有超过150万个阳性样本，对美国各州有全面的覆盖率。

Part 2 RT-PCR初筛

收集到的样本通过自动化核酸抽提系统，提取核酸样本，并进行RT-PCR这种通用性的方法来进行样本的初筛。RT-PCR结果显示是阴性的样本会被直接处理掉，阳性样本则通过自动化液体处理系统转移到特定的孔板中进行进一步的测序检测，挖掘更加深入的生物信息。

Part 3 PacBio HiFi测序

对于RT-PCR结果阳性的样本进行测序研究，构建1.2kb的扩增子文库，在PacBio Sequel II平台上进行HiFi测序，每一张8M的芯片可以实现600-1000个样本的测序。PacBio Sequel II高准确度长读长测序模式，可以实现全基因组的覆盖，高分辨率的检测，而且可以更加可靠的实现对新突变的检测。截至2020年12月8日，已经完成高质量测序的阳性样品数高达6700个，这对于病毒的完整解析是一个很好的开端。

Part 4 突变结果分析

LabCorp将测序得到的结果都和NCBI中武汉病毒株的序列进行了比对，发现了不同程度的突变类型。图中可以直观的看到突变位点以及不同突变位点的突变频率。突变频率最高的位点是在23,000左右，即D614G蛋白位点，在该研究数据库中大约有71%的病毒样本在此位点发生了突变。

随着时间的推移，基因组中的核苷酸突变频率也在增加，PacBio高准确度长读长测序技术可以实现完整的基因组覆盖，不会因为短读长测序技术的局限而造成新突变的漏检和丢失。当然，也可以设置阈值，来针对性的研究临床样本中出现的突变类型。（更多案例分享，请见文末视频讲解）

当然，也可以对突变频率最高的一些位点进行更加深入的研究，如下表中列出了突变频率最高的15种氨基酸突变位点。

Part 5 下一步计划

• LabCorp表示，接下来会对美国疫情初期的存档样品进行测序研究，从而还原COVID-19大流行初期SARS-CoV-2传播的原貌，包括何时何地何种基因型开始在美国传播以及如何随着时间的推移一步步的突变演化。
• 同时继续对接收到的新鲜样品进行测序，从而加强全球病原体的检测。
• 另一方面也会开展对宿主样本的测序工作并对每个阳性样本的HLA进行分型，利用全基因组关联研究来发现病毒与宿主基因之间的潜在关系。

Part 6 检测能力再度升级

近期，Labcrop决定继续增加PacBio Sequel II测序仪的采购，增强SARS-CoV-2病毒及其突变毒株的检测能力，每周可以从患者样本中产生数千个更完整的冠状病毒基因组，来追踪新冠病毒的传播和变异。

结语

作为第一个深受新冠病毒肆虐的地区和国家，我们不单承受了疫情带给我们的身体和心理的伤害，同时也承受了很多无端抹黑和莫须有的指责。目前并没有科学依据说是新冠病毒来源于中国，中国也是一个受害国家，不应为此背锅。新冠病毒的溯源工作任重而道远，我们应采用科学、有效的方法来进行溯源工作。LabCorp和PacBio的合作给了我们很好的启示，希望在全球科学研究者的共同努力之下早日打胜这场与新冠病毒的持久之战。

PacBio HiFi 测序

PacBio HiFi Reads目前是适用于各种基因组应用的优秀数据类型的典范，既兼顾长读长(up to 25kb)又具有高准确度(>Q20 准确率)。在病毒基因组研究中不会因为组装过程的错误而丢失突变位点，其准确性堪比Sanger测序，在病毒溯源、突变和演化过程的研究中可以发挥关键作用。

PacBio联合LabCorp专门推出针对SARS-CoV-2病毒测序的Protocol，提供可靠、经济、高通量的解决方案。单张芯片可以实现900个样品的混样测序，利用Sequel II/IIe 轻松得到准确度>99.9%的HiFi reads，帮助科学家更加准确深入地了解新冠病毒的来源、传播和变异。

Protocol链接：https://www.pacb.com/research-focus/microbiology/covid-19-sequencing-tools-and-resources/

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