拿一段已知的序列，让SMARTer RACE拓宽它的边界！

分子克隆实验中常用的PCR技术通常是以已知基因序列为前提进行的，可是在实际研究中，经常会遇到未知的基因序列，研究人员便开发了反向PCR、RACE以及SSH等一系列的扩增未知序列的PCR技术。随着NGS技术的飞速发展，获得生物样品的全部转录本序列早已不再是奢求，然而受实验规模和经费的限制，有时候NGS并不是你想做就能做的。回顾现有的获取未知序列的技术，RACE无疑是一个经典的选择。

RACE是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，即cDNA末端快速扩增技术，是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分区域已知序列为起点，扩增基因转录本的未知区域，从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法，也是快速扩增cDNA5’和3’末端的简单有效的方法。

RACE能解决什么问题？由于RACE技术能够获得全长cDNA，我们可以：

▪ 构建cDNA文库
▪ 对RNA的启动子、转录因子以及非编码区进行研究
▪ 获取已知片段旁侧序列，例如获得新发现的lncRNA的两端序列
▪ 利用RACE技术钓取基因家族候选新成员，为寻找同源基因提供新方法
▪ 鉴定预测基因是否真实准确以及对测序得到的某个序列再确认

【*在新冠疫情发现的初期，中国科学院武汉病毒研究所的研究人员就是使用Takara的SMARTer RACE 5′/3′试剂盒确认了2019-nCoV的5’末端序列，揭示了其在全基因组水平上与蝙蝠冠状病毒96%相同*1,已发表于《Nature》杂志。】

RACE如何操作？

传统的RACE方法应用“去帽法”原理：对Total RNA裸露的5‘磷酸基团进行去磷酸化，使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5’帽子结构，使用T4 RNA Ligase将5’RACE Adaptor连接到mRNA的5’端，反转录反应扩增cDNA，使用5’RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行PCR反应，扩增cDNA 5’末端的序列。

但传统的“去帽法”RACE有这样几个局限性：要求RNA起始量比较大，多个对RNA的处理、纯化步骤易导致RNA降解，实验步骤较多导致实验成功率较低等。

何以解忧？请看SMARTer RACE——突破传统方法的高效RACE！

SMARTer RACE方法能够解决传统方法的这些问题。SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术，即Switching Mechanism At the end of RNA Template，模板末端的转换机制，在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成，后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。

SMARTer RACE技术原理如下：

SMARTer技术的核心组分包括SMARTScribe反转录酶和SMARTer Oligo序列。 SMARTScribe反转录酶具有灵敏度高和延伸性能好的特点。根据我们的实验数据，SMARTScribe 反转录酶可以以低至10个拷贝的RNA为模板合成第一链cDNA；可获得长达14.6 kb的cDNA片段。

SMARTer RACE方法，除了引入了高灵敏度SMARTer cDNA合成技术，还引入了长、短两个PCR引物的设计来提高PCR特异性，并利用了Takara Bio Group专利的Suppression PCR技术，以降低PCR结果的背景，使RACE实验的成功率更高。

Suppression PCR降低PCR背景的原理如下图。当SMARTer Oligo这段序列与模板的某个位置形成错配后，在后续PCR过程中，这个错配得到的非特异性产物会形成一个锅柄状结构，不能与引物混合物中的短引物结合，也就不能作为模板被扩增，从而降低了PCR背景。

在PCR扩增了cDNA末端序列后，除了对PCR产物进行测序外，还需要将PCR产物克隆至载体后进行进一步的分析。SMARTer RACE试剂盒还引入了高效的In-Fusion无缝克隆技术，让克隆更高效，更简单。

综上所述，SMARTer RACE方法的优势非常明显：

▪ 高灵敏度，RNA起始量要求低，10 ng–1 μg total RNA或 poly A+ RNA均可
▪ 反转录酶和PCR酶的性能卓越，尤其针对于长片段和高GC含量基因
▪ 长短两个通用引物的设计，提高PCR扩增特异性
▪ 专利Suppression PCR技术，实现PCR低背景
▪ 专利In-Fusion无缝克隆技术，高效完成RACE片段的克隆

SMARTer RACE 5’/3’ Kit（Code No.634858/59）包含了RACE实验所需的全部核心试剂，一个试剂盒就是一个完整解决方案：

SMARTer RACE 5’/3’ Kit助力前沿应用

目前正值Takara火热促销期，SMARTer RACE等你来选，帮你拓宽已知序列的边界！

【参考文献】
1. Zhou P, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin[J]. Nature, 2020, 588(7836).