冠状病毒突变可能干扰COVID-19 PCR检测

研究人员发现，SARS-CoV-2变种可以逃避引物-探针集，并建议诊断分析包括多个目标，以提高可靠性。这项研究4月26日发表在《临床微生物学杂志》(Journal of Clinical Microbiology)上。

　　

根据4月26日发表在《临床微生物学杂志》(Journal of Clinical Microbiology)上的一项研究，SARS-CoV-2基因组的变化——包括目前流行的变种中发现的一些基因组变化——可能会对逆转录(RT) PCR检测病毒产生负面影响。这组研究人员提出，DNA引物识别位点的突变可能会减少病毒序列的扩增，从而可能阻碍在covid -19阳性个体的样本中检测病毒。

作者说，这一发现并没有引起全面恐慌。“我们认为这可能会更普遍。但事实证明，这种情况实际上相当罕见，”华盛顿大学病毒学家、共同作者David Wang说。Wang和他的同事建议诊断测试包括多个目标，以确保正确检测SARS-CoV-2。虽然许多产品已经包括多个基因靶点，但一些授权紧急使用的COVID-19 RT-PCR检测只检查一个。

用于RT-PCR分析的引物是在SARS-CoV-2病毒首次测序时在大流行早期开发出来的。基于其他冠状病毒的信息，研究人员设计了PCR引物来放大病毒基因组中被认为保持相对稳定的序列。这种方法已经取得了巨大的成功，从鼻咽拭子、唾液甚至污水样本中检测到SARS-CoV-2。

华盛顿大学(Washington University)巴恩斯犹太医院(Barnes-Jewish Hospital)的分子诊断实验室一直在使用罗氏(Roche)的cobas SARS-CoV-2检测来处理患者样本。它寻找病毒基因ORF1ab以及编码包膜蛋白的E基因。对于任何给定的样本，这些目标应该进行大致相同的PCR周期检测，这个值被称为周期阈值。

“如果你在一个基因上有很高的检测值，你在另一个基因上也有很高的值，反之亦然，”华盛顿大学临床病理学家和分子诊断实验室医学主任的共同作者Bijal Parikh说。虽然他的团队处理的大多数样本对这两个目标都有相似的周期阈值，但也有少数偏离了预期的相关性:有时，E基因没有像ORF1ab那样扩增到相同的程度。

尽管有这种奇怪的结果，但基于ORF1ab信号，检测仍然正确地识别了sars - cov -2阳性样本。为了弄清楚E基因发生了什么，研究小组对少量病毒样本进行了测序。他们发现三个样本在E基因中有一个常见的突变，而另一个样本在人群中流行的任何常见变异中都不存在。研究人员认为，该突变影响了PCR引物的结合，并干扰了扩增。

不幸的是，他们无法证实这一假设，因为该实验的引物和探针序列没有公开。然而，该突变位点符合广泛使用的E基因检测中引物的目标序列，该引物由德国柏林Charité - Universit?tsmedizin的研究人员开发。

9月份发表在《临床微生物学杂志》(Journal of Clinical Microbiology)上的另一项研究报告了类似的结果，Charité引物-探针集针对的E基因序列中不同位置的突变，也干扰了罗氏cobas SARS-CoV-2检测中的RT-PCR。2020年12月，加州大学旧金山分校(University of California, San Francisco)的生化学家艾米丽·克劳福德(Emily Crawford)及其同事在《临床微生物学杂志》(Journal of Clinical Microbiology)上发表了一项相关发现:SARS-CoV-2 N基因的突变，通过干扰引物结合，降低了RT-PCR测试的敏感性。SARS-CoV-2 N基因编码病毒的核衣壳蛋白。

Crawford说:“我们仍在研究该病毒最保守的区域和最不保守的区域。”“在我们真正确定这一点之前，我们必须保持警惕，为突变在任何地方出现做好准备。”

耶鲁大学公共卫生学院的病毒学家Chantal Vogels没有参与这项新工作，他说，科学界需要更多这类研究。她领导的一项研究于2020年7月发表在《自然微生物学》杂志上，该研究分析了SARS-CoV-2引物的敏感性和效率。研究人员发现，一个引物与其目标序列之间的不匹配导致测试敏感性降低。

PCR检测捕获一种正在进化的病毒

美国食品和药物管理局(FDA)已承认SARS-CoV-2突变可能干扰COVID-19检测，并继续监测变异并评估对诊断分析的潜在影响。该机构还向开发人员提供建议，让他们设计的测试尽量避免病毒突变，比如通过包括多个遗传目标。FDA还建议开发者注意可能改变测试性能和明确传达测试限制的突变。

“从一开始，我们就一直在密切关注所有不同的变体，”罗氏诊断解决方案的研发主管帕拉尼?库马雷桑(Palani Kumaresan)说。目前，该公司不打算改变测试方案。E基因信号是泛沙菌病毒，该病毒亚属包括SARS-CoV和SARS-CoV-2。一个sars - cov -2特异性信号来自Orf1ab。“当我们把这两者结合起来时，我们看不到任何影响，”Kumaresan说。尽管如此，罗氏仍在监测冠状病毒变异，以防其性能下降，并已启动了一项单独的SARS-CoV-2变异测试，用于研究目的。

美国疾病控制和预防中心(CDC)的一名媒体代表通过电子邮件告诉《科学家》，该中心定期监测COVID-19诊断小组和流感和COVID-19多重检测的引物和探针。CDC还通过基因组监测工作积极跟踪和描述冠状病毒变异。

Vogels说:“只要病毒持续变化——这是很自然的事情——你就需要持续监测。”“这些研究只会让我们的测试更好。”

S. Tahan等人，“SARS-CoV-2 E基因变异改变了使用商业RT-PCR检测病毒的分析敏感性特征”，《临床微生物杂志》，doi:10.1128/JCM。2021年00075 - 21日。