Molecular Cancer最新发表应用Arraystar Circular RNA芯片研究肝癌的文章

　　

复旦大学中山医院院长樊嘉院士在肝癌领域发表了CircMEMO1 modulates the promoter methylation and expression of TCF21 to regulate hepatocellular carcinoma progression and sorafenib treatment sensitivity.的研究性论文。该论文应用美国Arraystar公司的Arraystar Human CircRNA芯片筛选鉴定出与肝细胞癌发生相关的circRNA分子circMEMO1，发现它通过miR-106b-5p/TET1/5hmC/TCF21轴和EMT过程发挥作用。CircMEMO1作为一个关键的表观遗传修饰因子，还可以调节肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性。该研究成果发表在国际著名学术期刊Molecular Cancer(IF: 27.401)上。 （芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务）

通讯作者：
樊嘉，教授、博士生导师，中国科学院院士，复旦大学附属中山医院院长、肝外科主任。从事肝肿瘤外科临床与基础研究。近年来承担国家科技支撑计划等国家及省部级课题30余项；带领研究团队发表SCI论文150余篇，单篇最高引用约640次，包括：《Nature》、《Lancet Oncology》、《J Clinical Oncology》、《Gastroenterology》、《Hepatology》等。

施国明，博士，复旦大学附属中山医院肝脏外科主任医师，主要从事肝外科临床和肝癌基础研究工作。国家自然基金评审专家，在nature、Gastroenterology、Hepatology、Journal of Hepatology、Cancer Res发表多篇文章。

研究背景
肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC） 是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球第三大癌症相关死亡原因。肝硬化向肝细胞癌 发展是一个多步骤过程，从发育异常结节 (dysplastic nodules, DNs) 到 HCC 病灶，然后是小 HCC，最终是明显的肝癌。即使经过手术治疗，HCC 患者的总体预后仍不令人满意。

CircRNA 是一种由共价闭合环化形成的新型内源性非编码 RNA，在肿瘤发生及发展中起着至关重要的作用 。很少有研究报道CircRNA在HCC与癌旁组织的发育异常结节（DN）中的表达情况。

研究思路
本文作者采用Arraystar Human CircRNA芯片及激光捕获显微切割(LCM)技术，分析了肝癌组织和癌旁DN组织中CircRNA的表达谱。然后，利用体外和体内的肝癌模型来确定关键的CircRNA在肝癌进展和治疗敏感性中的作用和机制。作者发现，CircMEMO1在肝癌组织中的表达明显下调，并且其表达水平与肝癌患者的总生存期（OS）无病生存期(DFS)密切相关。功能实验表明，circMEMO1可以抑制肿瘤细胞的迁移侵袭并影响肿瘤的生长和转移。机制分析表明，CircMEMO1可以作为miR-106b-5p海绵，调控TCF21的启动子甲基化和基因表达，从而调节肝癌的进展。miR-106b-5p靶向Tet家族，增加TCF21启动子的5hmC水平。更重要的是，CircMEMO1可以增加肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性。

高通量筛选及临床数据研究
作者采用Arraystar Human circRNA Array 结合LCM 用于鉴定HCC 组织样本中与癌旁DN 样本相比差异表达的circRNA。确定了组间具有显著差异表达（差异倍数＞2倍，p值＜0.05）的circRNA，28个circRNA上调，18个circRNA下调（图1左上）。hsa_circ_0006790，称为circMEMO1，是下调最显著的一个circRNA（图1右上）。qRT-PCR 显示 circMEMO1 表达在 HCC 组织结节样本中显著下调（图1左下）。Kaplan-Meier 生存分析显示低表达 circMEMO1 的 HCC 的总生存期较差（图1右下）。

功能研究
为了研究circMEMO1在HCC进展中的生物学功能，作者构建过表达及敲低的circMEMO1慢病毒感染肝癌细胞系。通过细胞增殖、克隆和Transwell实验证明，敲除circMEMO1后Huh-7细胞的增殖、克隆和迁移能力显着增强；敲低circMEMO1时，HCCLM3细胞的增殖、克隆、侵袭和迁移能力受到显著抑制（图2左）。体外实验发现过表达circMEMO1可以显著抑制移植瘤的体积（图2右）。

机制研究
机制分析表明，CircMEMO1可以作为miR-106b-5p海绵，调控TCF21的启动子甲基化和基因表达，从而调节肝癌的进展。为了研究 circMEMO1 和 miR-106b-5p 之间的直接相互作用，作者设计生物素标记的circMEMO1 探针进行RNA pull down。qRT-PCR 结果显示 miR-106b-5p 在 Huh-7 中被 circMEMO1 探针能够拉下来（图3右上）。生信分析和荧光素酶实验证明，miR-106b-5p靶向Tet家族，通过抑制Tet表达来下调TCF21启动子的5hmC水平，进而抑制TCF21转录（图2左上下）。rescue实验表明TCF21过表达减弱由circMEMO1抑制或miR-106b-5p激活诱导的转移特性和EMT过程（图3右下）。更重要的是，CircMEMO1可以增加肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性。

技术路线

 

结果展示
circMEMO1在HCC中显著下调并与患者预后相关

 

图1. Arraystar Human CircRNA芯片筛选及验证结果。
图1：左上：HCC 组织样本中差异表达的 circRNA 与癌旁DN 样本相比的热图。（fold change≥2，p value＜0.05，n=3）。右上：circMEMO1 的示意图。左下：qRT-PCR 显示 circMEMO1 表达在 HCC 组织样本中显著下调。右下：Kaplan-Meier 分析表明 circMEMO1 表达下调与预后不良密切相关。

circMEMO1在HCC中抑制增殖和迁移侵袭

图2：CircMEMO1 在体外和体内抑制 HCC 细胞增殖和侵袭。
 左图CCK-8细胞增殖实验证实 circMEMO1 在 HCC 细胞增殖中的作用。右图：过表达CircMEMO1显著抑制移植瘤的体积。

circMEMO1 通过在 HCC 细胞中吸附 miR-106b-5p 来调节 TET/5hmC 轴的水平。
 

图3：CircMEMO1 通过在 HCC 细胞中吸附 MiR-106b-5p 来调节 TET1/5hmC/TCF21 轴的水平。

左上：circMEMO1与miR-106b-5p结合位点示意图，miR-106b-5p与TET1 和 TET2结合位点示意图。右上:circRNA RNA pull down qPCR显示CircMEMO1与mir-106b-5p可以结合。
左下：双荧光素酶报告基因实验证实mir106b-5p与TET1/TET2的3’UTR直接结合。右下：rescue实验表明TCF21过表达减弱由circMEMO1抑制或miR-106b-5p激活诱导的转移特性和EMT过程。

circMEMO1 通过 miR-106b-5p/TET1/5hmC 轴调节 HCC 进展的机制示意图

 

研究意义：
总之，在本研究中作者发现 CircMEMO1在肝癌转移和干细胞分化中是一个重要的肿瘤抑制因子，它通过miR-106b-5p/TET1/5hmC/TCF21轴和EMT过程发挥作用。作为一个关键的表观遗传修饰因子，CircMEMO1还可以调节肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性。

文章链接：

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01361-3

 

康成生物丨数谱生物可提供的相关技术服务

 

CircRNA 表达研究技术平台:

 

l CircRNA表达谱检测——Arraystar circRNA芯片：

 

针对CircRNA反向剪接位点设计特异性探针，准确检测circRNA，比测序更适合于circRNA表达谱分析。助力客户发表SCI文章超过350篇；

 

l circRNA qRT-PCR:

 

技术成熟，circRNA反向剪接位点设计引物，特异性检测目标circRNA。

 

l circRNA与蛋白互作(circRNA ChIRP-MS)

 

CircRNA可作为蛋白海绵或者蛋白结合的骨架，影响蛋白功能。 circRNA ChIRP-MS通过用biotin标记的RNA anti-sense与已交联的样本进行杂交，并通过固定化avidin对biotin进行Pull-Down，得到RNA结合蛋白（RBP）并通过质谱鉴定目标circRNA结合的蛋白。

 

 

外泌体组学：

 

外泌体分离、外泌体鉴定、外泌体转录组学及外泌体蛋白组学等

 

 

更多circRNA研究技术平台：

 

l circRNA m6A检测——Arraystar circRNA表观转录组芯片：

 

检测发生m6A修饰的circRNA；定量修饰百分比及修饰变化；total RNA要求量低至3ug。

 

l circRNA m6A 甲基化PCR检测：

 

（1）验证或者检测某个m6A 修饰的circRNA：m6A抗体富集发生m6A修饰的circRNA + circRNA反向剪接位点设计引物保证m6A-circRNA的精确检测

 

（2） 确定含有潜在m6ACA位点的circRNA是否真实发生m6A修饰：RNase R去线性RNA+ MazF酶处理 + m6ACA位点PCR检测 。