韩春雨发现的“NgAgo”被证明具有低温引导性DNA切刻酶活性

　　

与流行的CRISPR/Cas系统不同，原核Argonautes（pAgos）被认为是更灵活的基因编辑工具，因为它们不需要与其功能目标相邻的序列基序。

2014年荷兰瓦赫宁根大学教授John van der Oost在原核生物嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的Argonaute（Ago）蛋白家族中发现“TtAgo”能与具有向导作用的DNA结合，在65℃条件下切割目的DNA。但缺乏低温条件下切割活性。（doi:10.1038/nature12971）

2016年5月，中国韩春雨鉴定了另一种来源于嗜盐古生钠杆菌（Natronobacterium gregoryi）的Ago蛋白（命名为NgAgo）能够在37℃常温下结合向导DNA，实现基因编辑。2017年由于一直没有重复出实验结果，韩春雨团队因实验设计缺陷和不严谨的原因主动撤回了这篇发表在《Nature Biotechnology》上的题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章。

虽然韩春雨首先发现的NgAgo是否能作为哺乳动物基因编辑工具目前尚无定论，但普渡大学农业与生物工程助理教授Kevin V. Solomon等人在9月3日发表的《Nucleic Acids Research》中描述了其在原核生物中的功能。实验表明尽管NgAgo在非嗜盐宿主中表达较差，即使在复性后，大多数蛋白质仍不溶于水且无活性。然而，提纯的可溶性部分确实起到了DNA切刻内切酶（Nicking DNA Endonucleases）的作用。

NgAgo与其他具有催化活性的pAgo共享标准结构域，但也包含一个以前未被识别的单链DNA结合结构域（repA）。repA和标准PIWI结构域均参与NgAgo的DNA（单链）切割活动。NgAgo可以在大肠杆菌和体外3′端以外的1 nt处编辑，以切割靶向DNA。在大肠杆菌中，这种核酸内切酶活性对增强NgAgo引导的同源重组或基因编辑是必不可少的。在大肠杆菌内 NgAgo 在名为 repA 和 PIWI 两个功能性结构域的帮助下，NgAgo 可通过诱导其蛋白内靶向序列的双链断裂进而增强菌体内的基因同源重组。

这项研究结果证明了NgAgo在基因编辑方面的潜力，并为此前看似矛盾的报告提供了新的见解。

与CRISPR/Cas9相比，NgAgo有着不特定依赖于PAM序列、以DNA 为向导不易失效和脱靶、容错率低、效率高等一系列优点。因此，世界范围对NgAgo和Ago蛋白家族基因编辑潜力相关研究仍在继续，2019年2月，俄罗斯科学院/美国加州理工学院的Alexei A. Aravin课题组在预印本 BioRxiv 上描述了另外两种pAgo蛋白，Clostridium butyricum (CbAgo) 和Limnothrix rosea (LrAgo)，它们在生理温度下可在体外进行DNA介导的DNA切割。2020年俄罗斯科学院Andrey Kulbachinskiy等人测试了CbAgo的体内活性，他们的文章发表在《Nature》杂志，证明CbAgo靶向多拷贝遗传元件，并抑制质粒的传播和噬菌体的感染（doi: 10.1038/s41586-020-2605-1）。两项研究表明，在37℃条件下，CbAgo也许可以在真核细胞中具有活性。不过，迄今为止还没有用CbAgo进行人类细胞基因组编辑的可能，如果有，还需要更多优化。

原文检索：https://doi.org/10.1093/nar/gkab757