MIT：利用基因编辑系统CRISPR对小鼠肝脏进行全基因组研究

一项研究生物体内肝细胞的新技术可能会揭示再生所需的基因。

　　

肝脏的自我再生能力是很神奇的。即使70%以上的器官被切除，剩下的组织也可以再生出一个完整的新肝脏。

麻省理工学院生物学助理教授克里斯汀·克努斯(Kristin Knouse)希望找出肝脏是如何实现这种再生的，并希望了解如何诱导其他器官做同样的事情。为此，她的实验室开发了一种新方法，利用基因编辑系统CRISPR对小鼠肝脏进行全基因组研究。

有了这项新技术，研究人员可以研究老鼠基因组中的每个基因是如何影响特定的疾病或行为的。在一篇描述这项技术的论文中，研究人员发现了几个对肝细胞生存和增殖很重要的基因，这些基因之前在实验室培养皿中培养的细胞研究中没有发现过。

“如果我们真的想了解哺乳动物的生理和疾病，我们应该在任何可能的地方研究这些活的有机体的过程，因为这是我们可以在其最原生的环境中研究生物学的地方”。

Knouse是这篇新论文的资深作者，这篇论文今天发表在《细胞基因组学》杂志上。Whitehead研究所功能基因组学平台主任Heather Keys是这项研究的合著者。

细胞外环境

作为麻省理工学院的研究生，Knouse用再生的肝组织作为模型，研究细胞分裂的一个方面，即染色体分离。在这项研究中，她观察到肝脏细胞分裂的方式与实验室培养皿中的肝细胞分裂的方式不同。

她说:“我从这项研究中了解到的是，细胞分裂这种细胞固有的东西在多大程度上明显受到细胞外环境的影响，我们一直认为细胞分裂与细胞外的任何东西无关。”“当我们研究培养中的细胞时，我们失去了细胞外环境的影响。”

然而，许多类型的研究，包括使用CRISPR等技术的全基因组筛查，更难在整个生物体的规模上部署。CRISPR基因编辑系统由一种叫做Cas9的酶组成，它在一种叫做引导RNA的RNA链的指导下，在给定的位置切割DNA。这使得研究人员可以在大量细胞中敲除每个细胞中的一个基因。

虽然这种方法可以揭示与特定细胞过程有关的基因和蛋白质，但事实证明，要将CRISPR组件有效地传递到体内足够多的细胞中，使其用于动物研究是很困难的。在一些研究中，研究人员已经使用CRISPR敲除了大约100个感兴趣的基因，如果他们知道他们想研究哪些基因，这是有用的，但这种有限的方法并不能揭示与特定功能或疾病相关的新基因。

一些研究小组已经使用CRISPR在大脑和皮肤细胞中进行全基因组筛选，但这些研究需要大量的老鼠来发现显著的撞击。

Knouse说:“对我们来说，以及我认为许多其他研究人员来说，小鼠模型有限的实验可驾驭性长期阻碍了我们以公正和全面的方式深入研究哺乳动物生理和疾病问题的能力。”“这就是我真正想要改变的，把曾经局限于细胞培养的实验适应性带入有机体，这样我们就不再局限于探索生理学和疾病的基本原理。”

为了让引导RNA链进入肝细胞(肝细胞是肝脏中主要的细胞类型)，克努斯决定使用慢病毒，一种工程非致病性病毒，通常用于将遗传物质插入细胞基因组。她将导向RNA注射到新生小鼠体内，这样一旦导向RNA被整合到基因组中，它就会随着小鼠的生长而传递给后代的肝细胞。经过几个月的实验室努力，她能够在数千万个肝细胞中持续表达导向rna，这足以在单个动物中进行全基因组筛选。

细胞健康

为了测试这个系统，研究人员决定寻找影响肝细胞适应性的基因——肝细胞存活和增殖的能力。为此，他们提供了一个包含7万多个导向rna的文库，针对超过1.3万个基因，然后确定每种敲除对细胞适应性的影响。

用于研究的小鼠经过工程改造，Cas9可以在它们一生中的任何时候被打开。研究人员使用了一组4只老鼠——2只雄性和2只雌性——在老鼠5天大的时候启动了Cas9的表达。三周后，研究人员筛选他们的肝细胞，并测量每种引导RNA的含量。如果一种特定的引导RNA丰富，这意味着它的目标基因可以被清除，而不会对细胞造成致命伤害。如果引导RNA没有出现在屏幕上，这意味着敲除该基因对细胞是致命的。

这一筛选产生了数百个与肝细胞适应性有关的基因，结果在四只小鼠中非常一致。研究人员还将他们发现的基因与与人类肝病有关的基因进行了比较。他们发现，新生儿肝衰竭综合征中的基因突变也会导致筛查中的肝细胞死亡。

筛查还揭示了在实验室培养皿中培养的肝细胞研究中没有发现的关键健康基因。其中许多基因参与了与免疫细胞或细胞外基质分子的相互作用。这些途径可能没有在培养细胞的筛选中出现，因为它们涉及细胞与外部环境的相互作用，Knouse说。

通过比较雄性和雌性小鼠的结果，研究人员还发现了几个对健康有性别特异性影响的基因，这是不可能通过单独研究细胞来获得的。

更新和再生

Knouse现在计划使用这个系统来识别对肝脏再生至关重要的基因。

“许多组织，如心脏，无法再生，因为它们缺乏干细胞，分化的细胞无法分裂。然而，肝脏也是一种高度分化的组织，缺乏干细胞，但它在受伤后仍保留这种惊人的自我再生能力，”她说。“重要的是，肝细胞的基因组与心脏细胞的基因组并无不同。所有这些细胞的细胞核中都有相同的操作手册，但肝细胞为了再生，显然在阅读手册中的不同句子。我们不知道的是，这些句子是什么?这些基因是什么?如果我们能识别出这些基因，也许有一天我们可以指导心脏再生。”

这种新的筛查技术也可以用于研究脂肪性肝病和肝硬化等疾病。克努斯的实验室还致力于将这种方法扩展到肝脏以外的其他器官。

她说:“我们需要找到让引导rna高效进入其他组织的方法。”“通过克服这一技术障碍，我们就可以建立我们现在在肝脏、心脏或其他问题上拥有的同样的实验适应性。”

该研究由美国国立卫生研究院NIH主任早期独立奖、国家癌症研究所科赫研究所支持(核心)赠款以及斯科特·库克和西格·奥斯特比基金资助。