日本科学家：一种优化的基因组编辑，减少了治疗中的突变

尽管CRISPR-Cas9作为一种简单的基因组编辑技术被广泛使用，但它与副作用有关，如不必要的突变和毒性。现在，九州大学和名古屋大学医学院的研究人员开发了一种基因组编辑优化方法，可以大幅减少突变，为更有效地治疗遗传疾病打开大门，减少不必要的突变。

　　

CRISPR-Cas9被广泛用于通过研究感兴趣的基因和修改疾病相关基因来编辑基因组。然而，这一过程与副作用有关，包括不必要的突变和毒性。因此，需要一种新技术来减少这些副作用，以提高其在工业和医学上的实用性。现在，日本南部的九州大学和中部的名古屋大学医学院的研究人员开发了一种优化的基因组编辑方法，极大地减少了突变，为更有效地治疗遗传疾病打开了大门，减少了不必要的突变。他们的研究结果发表在《Nature Biomedical Engineering》杂志上。

以CRISPR-Cas9为中心的基因组编辑技术已经彻底改变了食品和医药行业。在这项技术中，Cas9核酸酶(一种切割DNA的酶)与一种合成的引导RNA (gRNA)一起被引入细胞，引导酶到所需的位置。通过切割基因组，不需要的基因可以被删除，新的(有功能的)基因可以被轻松快速地添加进来。

基因组编辑的缺点之一是人们越来越担心突变和脱靶效应。这通常是由酶靶向与目标位点序列相似的基因组位点引起的。同样，当基因发生改变时，染色体水平的突变也会发生，这阻碍了癌症基因治疗的临床试验，甚至导致正在接受肌肉萎缩症治疗的患者死亡。该小组假设，目前使用Cas9的编辑协议会导致过度的DNA切割，导致一些突变。

为了验证这一假设，由九州大学助理教授Masaki Kawamata和名古屋大学医学研究生院教授Hiroshi Suzuki组成的研究小组在小鼠细胞中构建了一个名为“AIMS”的系统，该系统分别评估了每条染色体上Cas9的活性。他们的结果表明，常用的方法与非常高的编辑活性相关。他们确定这种高活性会导致一些不必要的副作用，所以他们寻找可以抑制它的gRNA修饰方法。他们发现，gRNA 5'端额外的胞嘧啶延伸可以有效地作为过度活性的“保护”，并允许控制DNA切割。他们称这种微调系统为‘护卫gRNA’([C]gRNA)。”

他们的结果是惊人的。使用他们的新技术，脱靶效应和细胞毒性降低，单等位基因选择性编辑的效率提高，同源定向修复的效率，最常用的DNA双链断裂修复机制，得到了增强。

为了测试它在医疗环境中的有效性，他们研究了一种叫做进行性骨化性纤维发育不良的罕见疾病。通过使用小鼠模型，他们能够创造出与人类疾病相同的基因型。然后，使用患者来源的iPS细胞，他们能够精确地修复损伤，特别是导致疾病的疾病相关等位基因中的单个核苷酸，这证明了他们的技术作为一种安全有效的基因治疗方法的有用性。

该团队还构建了第一个各种基因组编辑模式与Cas9活性之间相关性的数学模型，这将使用户能够在整个细胞群中模拟基因组编辑的结果。这一突破将使研究人员能够确定Cas9的活性，从而最大限度地提高效率，减少所需的巨大成本和人力。

“我们建立了一个新的基因组编辑平台，通过开发具有适当Cas9活性的活性调节[C]gRNAs，可以最大限度地提高所需的编辑效率。此外，我们发现‘护卫gRNA’可以通过调节gRNA的活动来应用于各种需要gRNA的CRISPR工具，例如使用Cas12a的工具，Cas12a具有不同的DNA切割机制。对于使用Cas9激活或抑制感兴趣基因的技术，如CRISPR激活和CRISPR干扰，过度诱导或抑制基因表达可能对细胞没有用处，甚至对细胞有害。通过[C]gRNA控制表达水平是一项重要的技术，可用于各种应用，包括精确基因治疗的实施。”

该小组目前正在制定一项启动商业计划，以推广新的基因组编辑平台。Kawamata博士说:“特别是，我们相信这项技术可以为医疗领域做出重大贡献。我们目前正在细胞和动物实验中评估其对选定目标疾病的治疗效果和安全性，并利用它来帮助开发治疗药物和基因治疗方法，特别是对于尚未建立治疗方法的罕见疾病。”

Optimization?of Cas9 activity through the addition of cytosine extensions to single-guide RNAs