Nature子刊：CRISPR基因剪刀的活动可视化

莱比锡大学的科学家与立陶宛维尔纽斯大学的同事合作，开发了一种新方法，可以在几毫秒内测量分子的最小扭曲和扭矩。该方法可以实时跟踪CRISPR-Cas蛋白复合物的基因识别，也被称为“基因剪刀”，具有最高的分辨率。利用获得的数据，可以准确地描述和建模识别过程，以提高遗传剪刀的精度。由物理和地球科学学院的Ralf Seidel教授和Dominik Kauert教授领导的研究小组获得的结果现已发表在著名的《自然结构与分子生物学》杂志上。

　　

当细菌受到病毒的攻击时，它们可以通过一种机制来保护自己，这种机制可以抵御入侵者引入的遗传物质。关键是CRISPR-Cas蛋白复合物。直到最近十年，它们在微生物适应性免疫中的作用才被发现和阐明。在嵌入RNA的帮助下，CRISPR复合体识别出攻击者DNA中的短序列。RNA序列识别机制已被用于选择性地关闭和修饰任何生物体中的基因。这一发现彻底改变了基因工程，并于2020年将诺贝尔化学奖授予了Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna。

然而，偶尔，CRISPR复合物也会对与RNA指定的序列略有不同的基因片段产生反应。这在医疗应用中会导致不良的副作用。“这其中的原因还没有被很好地理解，因为这个过程直到现在还不能直接观察到”。

详细跟踪了纳米级工艺

为了更好地理解识别过程，由Ralf Seidel教授和Dominik Kauert教授领导的团队利用了目标序列的DNA双螺旋在识别过程中被解开的事实，以实现与RNA的碱基配对。“因此，该项目的核心问题是，能否实时跟踪只有10纳米(nm)长的DNA片段的展开。”

为了详细观察解绕过程，科学家们必须使其在显微镜下可见。为了实现这一目标，研究小组利用了DNA纳米技术的成果，该技术可用于创建任何三维DNA纳米结构。利用这种所谓的DNA折纸技术，研究人员构建了一个75纳米长的DNA转子臂，末端附着了一个金纳米颗粒。在实验中，2nm薄10nm长的DNA序列的展开被转移到沿着直径160 nm的圆旋转的金纳米粒子上，这种运动可以通过特殊的显微镜装置放大和跟踪。

通过这种新方法，研究人员能够观察到CRISPR级联复合体对序列的识别，几乎是碱基对对。令人惊讶的是，与RNA的碱基配对在能量上并不有利，这意味着该复合物仅在序列识别期间不稳定地结合。只有当整个序列被识别时，稳定的结合才会发生，DNA随后被破坏。如果是“错误的”目标序列，则中止该进程。

研究结果将有助于选择合适的RNA序列

事实上，识别过程有时会产生不正确的结果是由于其随机性，即随机分子运动，正如研究人员现在能够证明的那样。“序列识别是由碱基配对的热波动驱动的，”Kauert说。利用获得的数据，可以创建一个描述偏离序列段识别的序列识别热力学模型。在未来，这应该允许更好地选择RNA序列，只识别所需的目标序列，从而优化遗传操作的精度。

由于所设计的纳米马达在测量单个分子的扭曲和扭矩方面具有普遍性，因此它们也可用于其他CRISPR-Cas复合物或生物分子。

这项工作由欧洲研究理事会和德国研究基金会资助，并与立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys教授的研究小组合作进行，他分离并提供了所使用的CRISPR复合物。

文章标题

The energy landscape for R-loop formation by the CRISPR–Cas Cascade complex