双CRISPR-Cas3系统恢复来自杜氏肌营养不良症患者的营养不良蛋白功能

杜氏肌营养不良症(DMD)是一种由肌营养不良蛋白基因突变引起的肌肉退行性疾病。研究人员展示了双CRISPR RNA方法如何恢复来自DMD患者的诱导多能干细胞的肌营养不良蛋白功能。这种方法是通过去除肌营养不良蛋白基因的大部分，使细胞跳过有缺陷或不对齐的遗传密码部分。这产生了与DMD相关的各种突变模式的截短但仍有功能的蛋白质。

　　

京都大学的资深作者Akitsu Hotta说:“双CRISPR-Cas3是一种很有前途的工具，可以通过多外显子跳变诱导来诱导巨大的基因组缺失和恢复肌营养不良蛋白。”“我们希望这项研究能够启发治疗DMD患者和其他需要大量缺失的遗传疾病的新方法。”

由于影响肌营养不良蛋白基因的突变模式存在显著差异，删除一小部分基因只能用于有限数量的DMD患者。例如，最常见的外显子51、53和45的单外显子跳跃分别适用于13%、8%和8%的DMD患者。

多外显子跳变(MES)广泛适用于多种DMD突变模式。通过靶向抗肌营养不良蛋白基因的突变热点，估计外显子45至55的MES使60%以上的DMD患者受益。不幸的是，很少有技术可以诱导大面积的删除，以覆盖分布在几百个碱基上的目标外显子。

为了克服这一障碍，Hotta和他的团队使用CRISPR-Cas3在各种DMD突变模式的抗营养不良蛋白45-55外显子区域诱导了多达340千碱基的缺失。由于使用单个CRISPR RNA(这有助于定位正确的DNA片段)很少观察到超过100个碱基的删除，因此研究人员在目标基因组区域内部使用了一对CRISPR RNA。

作者指出了双CRISPR RNA系统的潜在局限性。首先，缺失模式存在变异，缺失的精确起点和终点无法完全控制。当需要大量但精确的删除时，这可能是一个缺点。其次，该研究没有证明恢复的肌营养不良蛋白的功能。第三，需要开发其他方法来提高Cas3系统的整体基因组编辑效率。

Hotta说:“一旦我们能够将体内的双cas3成分安全有效地输送到骨骼肌组织，我们的双cas3系统可能会应用于未来的基因治疗。”“诱导数百个DNA碱基缺失的能力本身在需要大量缺失的基础研究中也具有广泛的适用性。”

这项研究得到了日本医学研究与发展机构、日本科学促进会、iPS细胞研究基金和国家神经病学和精神病学中心的部分支持。Akitsu Hotta是C4U的科学顾问，几位共同作者已经就这项研究提交了专利。

Journal Reference:

1. Yuto Kita, Yuya Okuzaki, Youichi Naoe, Joseph Lee, Uikyu Bang, Natsumi Okawa, Akane Ichiki, Tatsuya Jonouchi, Hidetoshi Sakurai, Yusuke Kojima, Akitsu Hotta. Dual CRISPR-Cas3 system for inducing multi-exon skipping in DMD patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports, 2023; DOI: 10.1016/j.stemcr.2023.07.007