病理医师经验谈：使用FFPE组织进行单细胞分析的好处

在最近召开的网络研讨会上，德国柏林Charité医学院的Philip Bischoff博士分享了他采用Chromium单细胞基因表达Flex分析这些样本类型的经验，而我们也借机采访了他。

病理医师如何应对疾病诊断的关键问题？哪些工具能帮助他们更深入地了解导致疾病的细胞过程？过去，组织学方法推动了诊断，但近年来，高度灵敏的分子检测（包括单细胞分析）开始为更深入地分析组织复杂性开辟了新道路。有了这些互补方法，这个领域更有可能迈向个性化医疗。

许多单细胞基因表达分析方法的一个普遍要求是使用新鲜样本。对病理医师来说，这会带来一些样本运输方面的挑战，因为只有当您开始收集组织时，您的研究才能开始，整个工作流程需要精心规划，并与临床合作伙伴协调。此外，您还必须迅速采取行动，将样本速冻或在当天进行解离和处理。

Philip Bischoff博士在10x Genomics网络研讨会“FFPE组织的单细胞分析：病理医师谈分析经验和考虑因素”中的屏幕截图。https://www.10xgenomics.com/videos/14oda4rnyh?autoplay=true

除了花费时间和精力，这种前瞻性取样可能受限于现有的样本类型。一些确定研究具体方向或范围的信息（比如肿瘤亚型或驱动突变）可能在手术后数日或数周都无法获得。

将FFPE样本的单细胞分析引入病理学领域

Philip Bischoff博士在德国柏林Charité医学院担任病理住院医师和临床科学家，他主要研究肺部肿瘤的复杂性，尤其关注肿瘤微环境。他一直在探索FFPE组织的使用将如何改变单细胞分析对病理学领域的影响，从而实现回顾性样本的研究。将FFPE组织纳入研究范围也意味着人们能够根据设定的标准（包括疾病状态、特定突变、治疗细节和患者应答）来选择患者样本，并解决重要的临床问题。

Philip Bischoff博士在10x Genomics网络研讨会“FFPE组织的单细胞分析：病理医师谈分析经验和考虑因素”中的屏幕截图。https://www.10xgenomics.com/videos/14oda4rnyh?autoplay=true

在最近召开的网络研讨会上，Bischoff博士分享了他采用Chromium单细胞基因表达Flex分析这些样本类型的经验，而我们也借机采访了他。他的团队系统比较了三种非小细胞肺癌的新鲜和速冻组织，以及长期保存的完全相同肿瘤的对应FFPE组织块。由此获得的scRNA-seq数据让他们能够分析各个样本类型之间的细胞类型数量和基因表达模式，并深入探究患者的基因特征与不同肿瘤形态之间的相关性。

欢迎扫码观看此次网络研讨会的完整回放视频，您将了解：

01 不同样本类型之间的基准数据以及影响数据质量的因素

02 观察到的转录组图谱与侵袭性更强的肿瘤之间的关系

03 实验方面的考虑因素和方案优化

04 单细胞分析如何帮助研究人员推进转化研究

阅读下文，听听Bischoff博士在现场问答环节回答的一些问题，以及10x Genomics的单细胞应用产品市场经理Angela Churchill博士的一些补充看法。

在FFPE样本上进行单细胞RNA测序的好处

是否有一些组织，对新鲜样本进行单细胞解离后获得的结果质量不佳，而使用Flex试剂能获得更好或质量更高的数据？

Churchill：没错！在处理新鲜组织时，您在样本制备方面有几种不同的选择。研究人员可以将其解离成单细胞，可以分离出细胞核，也可以使用我们称为Chop/Fix的方法。

对于一些解离难度较大或RNA质量较低的样本，Flex的表现可能会特别好，因为它采用的是基于探针的检测方法，而且探针设计只需要15个核苷酸序列。

FFPE组织中是否发现了新鲜组织中遗漏的细胞类型（可能因处理过程受损）？

Bischoff：在新鲜组织的机械解离过程中，受影响最大的细胞是上皮细胞，因为上皮细胞习惯于在组织中生长。在解离后，它们会进入细胞凋亡状态，因此我们发现新鲜组织有着更高的细胞应激特征评分，但在FFPE组织中未发现。

相反，在FFPE组织中，我们看到了更多的成纤维细胞，这非常有趣，因为成纤维细胞是许多癌症研究人员感兴趣的细胞类型。不过很难从新鲜组织中分离出成纤维细胞，因为它们周围有大量的细胞外基质（即胶原蛋白），很难对其进行解离。从FFPE组织中获得这些细胞要容易一些。

关于您的（FFPE人类肺部肿瘤）研究，您能解释一下肿瘤形态与单细胞基因表达特征之间的关系吗？

Bischoff：我们发现，在形态分化程度较高的肿瘤中，这些肿瘤的特征基因也能在正常肺上皮细胞中找到。因此，这种基因特征反映出这些肿瘤与正常肺上皮细胞的关系更密切。

而在分化程度较低的肿瘤中，这些基因的表达量极低。相反，我们看到的基因特征反映了EGFR信号转导和TGF-β信号转导的强度更高。然而，在这些分化程度较低的肿瘤中，正常上皮细胞的基因特征却消失了。

三名患者的人类FFPE肺部肿瘤切片，左侧显示的是鳞状生长模式（类似于正常的肺部形态），右侧是实性生长模式（未分化的肿瘤组织）。Bischoff博士利用新鲜组织开展了单细胞分析，以确定与这些肿瘤形态和肿瘤分级相关的基因特征，然后将其应用于FFPE组织。新鲜组织和FFPE组织的单细胞数据都反映了不同肿瘤形态之间的基因表达特征差异，这让人们确信，通过对FFPE组织的形态特征和相同FFPE样本的单细胞数据进行配对研究，可以获得更多信息。图片来源：Philip Bischoff博士在10x Genomics网络研讨会“FFPE组织的单细胞分析：病理医师谈分析经验和考虑因素”中的屏幕截图。https://www.10xgenomics.com/videos/14oda4rnyh?autoplay=true

FFPE样本的单细胞分析流程中的考虑因素

在解离步骤中，你们使用的是Octo组织解离器还是研磨法？

Bischoff：我们主要使用Octo组织解离器，但对于较小的组织样本，我们也用了研磨法。这两种方法都很有效。

您能详细介绍一下在解离不同组织类型方面的经验吗？特别是，根据组织类型和FFPE切片厚度的不同，是否有不同的解离设置？（你们会在gentleMACS仪器上设置程序吗？）

Bischoff：我们的经验也很有限。我们还没有在多个组织上进行测试，但我可以说，如果组织中含有大量胶原蛋白基质，解离起来就比较困难——例如，乳腺组织中有大量纤维组织。对我们有用的是延长解离时间。因此，我们在Octo组织解离器上运行了两次程序。我们还使用了一种更剧烈的程序，它的旋转速度更高。于是，我们用它来优化乳腺组织的解离方案。这可能也适用于其他组织类型。

您能详细介绍一下从FFPE组织块到测序完成的工作流程中有哪些停止点吗？

Churchill：在仪器内生成单细胞微滴之前，基本上有两个可选的停止点。一个是在固定后——在这种情况下，实际上是FFPE组织块。另一个可选的停止点是探针杂交步骤后。

Bischoff：是的。正如我刚才所展示的，我们特别利用第二个停止点来增加一步额外的FACS分选，这对于细胞计数和碎片清除很有帮助。

既然是FFPE样本，您在FACS分选时使用了DAPI吗？

Bischoff：对，我们对细胞核进行了DAPI染色，但这并没有影响我们的分析。

影响FFPE组织块的数据质量的决定因素

FFPE组织块的年限对结果有何影响，如何对年代久远的FFPE组织块进行质量控制？

Bischoff：这是一个很有意思的问题，我希望我能给出一个明确的答案，因为我们自己也在问这个问题。我认为，FFPE组织块的年限可能并不是那么重要，因为我们发现，对于年限很短的FFPE组织块（只有几个月）和年限较长的FFPE组织块（两三年），我们获得了相同质量的结果。

我认为，第一步的组织进行福尔马林固定做得好不好可能更重要。如果组织的福尔马林固定效果很差，那么即使是年限较短的FFPE组织块，RNA质量也会很差。

第二个问题，如何确保FFPE组织的RNA质量良好？老实说，在开始单细胞分析之前，我们并没有检查过RNA的质量。但我认为，这是一种基于探针的方法，因此即使RNA的降解程度较高，也能获得相当好的结果。

立即固定对FFPE样本质量至关重要的说法，我完全同意。您如何看待固定时间？根据您的经验，固定时间越长越好吗？

Bischoff：时间长不一定好。我们没有在实验室测试过这一点，但有一位研究这个的同事告诉我，与只固定24小时的样本相比，长时间福尔马林固定（几天）的样本可能在RNA质量上表现更差。因此，长时间的福尔马林固定可能是一个不利因素。

您在处理有坏死区域的FFPE组织方面有经验吗？我自己就遇到过生成的数据中转录本数量较少的情况。

Bischoff：是的。坏死区域的RNA数量和质量都很差，这听起来很有道理。我们没有分析过任何坏死肿瘤。我宁愿将坏死区域排除在外，因为我预计RNA质量不佳。这也是FFPE组织的优势——你可以仔细观察组织，然后选择高质量的组织，排除低质量的组织。

FFPE样本的用量和稳定性

具体来说，从组织块、组织芯或厚切片*中采集的FFPE样本稳定性如何？

Bischoff：我们还没有进行过系统测试。但我猜测，组织芯（cores）可能更稳定一些，因为它的表面积更小，与空气接触的面积更少。厚切片（curls）的质量可能受到影响，但这只是猜测，我们还没有测试过。

样本量有限制吗？例如，组织芯是否太小而无法分析？

Bischoff：首先，这取决于组织类型。如果你的组织非常致密，细胞密度高，那么需要的体积自然就小。如果组织的细胞密度较低，则需要较大的体积。对于细胞密度较高的非小细胞肺癌，最小的样本量需要一份组织芯，我在演讲中也展示了这一点。因此，一份直径为1 mm或1.5 mm的组织芯就够了。

所以，组织芯片（TMA）的一份组织芯可能就够了，但你将要用这整份组织芯。您将无法在这个FFPE组织块上进行额外的染色。这可能是分析所需的最低起始量。

*此处的组织芯指的是组织打孔活检，而厚切片指的是整张组织切片，两者都取自FFPE组织块。

Philip Bischoff博士在10x Genomics网络研讨会“FFPE组织的单细胞分析：病理医师谈分析经验和考虑因素”中的屏幕截图。https://www.10xgenomics.com/videos/14oda4rnyh?autoplay=true

数据质量和基因表达谱

对于新鲜组织和FFPE组织，哪些类型的差异表达基因相关性较差，是否有一定模式？

Bischoff：这是个好问题。我们没有发现某个特定基因家族的相关性很差。相反，低表达基因的相关性可能较低，但高表达基因（如细胞类型标志物）的相关性非常好。因此，这可能与基因的表达强度有关。

与新鲜冷冻样本相比，FFPE样本中是否存在尚未被详细表征的特定免疫细胞？例如，您是否发现髓系细胞在FFPE和新鲜冷冻样本中存在差异？

Bischoff：我们没有观察到这一点。事实上，我们发现FFPE组织中的所有细胞类型在新鲜组织中都能找到。它们之间极具可比性。至于其他免疫细胞，细胞类型和细胞亚型的数量也相当。

您可以访问10x Genomics的网站或这篇关于单细胞Flex的样本制备文章，了解利用基因表达Flex开展FFPE单细胞分析的更多信息，我们的科学家在文章中介绍了许多有用的资源和建议。关于感兴趣的组织，您有具体问题吗？欢迎查看技术支持团队提供的已测试组织列表（不断更新中）。

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