兔乳寡糖多样性及其对幼兔盲肠微生物群发育和生存的影响机制研究

本研究首次系统表征了兔乳寡糖(MOs)的组成多样性及其动态变化，揭示了其与幼兔盲肠微生物群建立和生存率的潜在关联。通过MALDI-TOF MS技术分析76只母兔的乳汁样本，发现49种寡糖结构且以唾液酸乳糖(SL)为主导。纵向研究显示泌乳阶段显著影响MO组成，特定MO与幼兔肠道菌群（如Fusicatenibacter）存在显著相关性。该研究为理解兔乳寡糖的生物学功能及其在新生儿发育中的预 biotic作用提供了重要依据。

　　

在哺乳动物早期发育过程中，乳汁不仅是营养来源，更是重要的生物活性物质载体。其中乳汁寡糖（Milk Oligosaccharides, MOs）作为第三大固体成分，在新生儿肠道微生物群定植和免疫系统成熟中扮演着关键角色。尽管人类和部分家畜的MOs研究已较为深入，但对兔乳寡糖的认知仍存在显著空白。这种认知缺失尤其令人遗憾，因为兔作为典型的晚成性动物（altricial species），其幼崽出生时存在显著的生理不成熟现象——无毛、失明、活动能力有限，且完全依赖每日单次哺乳存活。这种发育特性使得兔成为研究MOs功能机制的理想模型。更值得注意的是，商业养殖条件下幼兔从出生到市场日龄（70天）的死亡率高达26%，其中19%发生在断奶前，这为探究MOs与幼崽生存率的关联提供了现实意义。

为填补这一研究空白，由Sylvie Combes领衔的法国图卢兹大学研究团队在《The Journal of Nutrition》上发表了开创性研究。研究人员立足于两个关键科学假设：兔乳寡糖组成的多样性可能驱动肠道微生物群的建立，并解释幼兔生存率的个体差异。为此，他们设计了系统的两阶段实验方案，旨在实现四个核心目标：首次全面表征兔乳寡糖组成；评估泌乳过程中MOs谱的动态变化；探究MOs与幼兔生存率的关联；探索母体MOs与后代盲肠微生物群组成的联系。

研究团队运用矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）这一高效指纹图谱技术，对76只母兔在第二次泌乳周期（第8-10天）的乳汁样本进行寡糖分析。为确保研究结果的可靠性，团队采用随机分批处理样本，并引入人乳样本作为质量控制。在第二阶段，基于唾液酸乳糖（Sialyllactose, SL）相对丰度的差异，筛选10只母兔（高SL组和低SL组各5只）进行纵向追踪，在第七个泌乳周期的第2/3、7、17和25天采集系列样本。同时，在每个泌乳阶段采集幼兔盲肠内容物，通过16S rRNA基因测序和核磁共振（¹H NMR）代谢组学分析微生物群落结构和功能。此外，研究还记录了67只母兔连续七个繁殖周期的后代生存数据，从而构建起完整的母体-后代关联数据库。

兔乳寡糖谱多样性及变异性

质谱分析共鉴定出49种独特单糖组成的寡糖结构，其中3种核心MOs存在于所有样本：SL（Hex₂NeuAc₁）以70.8%的相对丰度占据主导地位，乳-N-岩藻五糖（LNFP, Hex₃HexNAc₁Fuc₁）和Hex₂HexNAc₁分别占6.9%和2.5%。值得注意的是，虽然唾液酸化MOs在数量上仅占35%，但其总相对丰度高达83.9%，而岩藻糖基化结构虽占比70%，总丰度仅为13.1%。个体间变异分析显示，每只母兔的寡糖种类介于7-26种之间，中位数为13种，表明存在显著的个体差异。

泌乳阶段与繁殖周期对MOs的影响

纵向监测发现泌乳阶段显著改变MOs组成（图5）。SL在泌乳后期（第25天）相对丰度下降2.5倍，而LNFP、乳-N-四糖（LNT/LNnT）等中性岩藻糖基化寡糖则显著增加。值得注意的是，第二次泌乳周期中基于SL丰度分组的差异（HSL vs LSL）在第七个周期中消失，提示MOs谱可能受胎次因素调控。与现有数据库（MilkOligoDB和Jin等）比对显示，兔乳中46种MOs结构与其他哺乳动物共享，但Hex₃HexNAc₂Fuc₁_NeuAc₁等3种复杂结构为兔特有。

MOs与后代微生物群及生存率的关联

相关性分析揭示特定MOs与微生物群的显著关联（图6）。在8日龄幼兔中，岩藻糖基乳糖（FL）与Fusicatenibacter相对丰度呈正相关（r>0.6）。至26日龄，Oscillospiraceae NK4A214群与Hex₄HexNAc₁Fuc₁正相关，而Ruminococcus、Alistipes和Coprococcus分别与唾液酸乳-N-岩藻五糖（F-LST）、Hex₃HexNAc₂Fuc₁和唾液酸乳-N-四糖（LST）负相关。代谢组关联分析表明，在8日龄时，12种MOs与11种盲肠代谢物（如乙酸、氨基酸衍生物）存在显著相关性，但这种关联在26日龄减弱，可能与固体饲料摄入干扰有关。令人意外的是，尽管幼兔生存率在母兔间存在显著差异（每只母兔断奶仔数15-63只），但其与第二次泌乳周期的MOs谱关联较弱（相关系数<0.4），提示可能需要结合多胎次数据才能揭示完整规律。

本研究通过多维度分析系统阐明了兔乳寡糖的四个核心特征：首先，兔乳寡糖以唾液酸化结构为主导，但岩藻糖基化程度显著高于其他已研究物种；其次，MOs组成呈现显著的个体变异性和泌乳动态变化，特别是LNFP在晚期泌乳的富集现象可能具有特殊生物学意义；第三，特定MOs（如FL、F-LST）与幼兔肠道菌群定植存在显著关联，支持其预 biotic功能假说；最后，母体MOs谱与后代生存率的弱关联性提示需要更精细的研究设计来解析其生理意义。

这项研究不仅填补了兔乳寡糖研究的空白，更为理解MOs在晚成性动物发育中的作用提供了新视角。特别是兔乳中高比例的岩藻糖基化结构（70%的MOs含岩藻糖）与人类乳寡糖的特征相似，暗示兔可能成为研究岩藻糖基化MOs功能的理想模型。未来研究若能结合异构体水平的结构解析和靶向干预实验，将进一步揭示兔乳寡糖在促进肠道健康和提高幼畜存活率方面的应用潜力。