基于结构优化的SARS-CoV-2受体结合域在大肠杆菌中的高效表达与功能重构研究

本文报道了通过优化SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的ORF边界，在大肠杆菌系统中实现高效表达与体外重构的创新策略。研究团队采用定制化重构方案，从1升LB培养基中获得10–12 mg具有高亲和力（KD<10 nM）的活性RBD蛋白，为COVID-19抗病毒药物研发提供了关键靶点蛋白的生产方案。

　　

Section snippets

Constructs

基于先前报道，我们考虑了两种RBD表达序列边界（Lan等人，2020；Wrapp等人，2020）。多肽链从"Arg319到Ser591"和"Asn331到Ser530"分别命名为RBD-1和RBD-2。携带RBD-1的pET-28a (+)表达质粒为定制合成（Genscript）。该开放阅读框（ORF）带有N端6× His标签和用于标签切除的TEV蛋白酶识别位点。还进行了额外的基因克隆操作。

Boundary optimization of RBD

我们首先获得了编码RBD-1多肽的表达质粒，其N端带有TEV切割位点和His₆标签。N端的His₆标签使得能够通过固定金属亲和层析（IMAC）进行一步法亲和纯化，并便于通过表面等离子共振（SPR）进行结合实验，其中蛋白可固定于Ni-NTA芯片上。

我们最初的目标是生产有活性的可溶性蛋白。然而，当在大肠杆菌中表达时，目标蛋白主要以包涵体形式存在。这促使我们探索不同的重构策略以获得功能性蛋白。

Conclusions

总之，我们成功优化了RBD序列边界，实现了高效的原核表达，重构后活性蛋白回收率约为10%。这一成果在双His₆标签和MBP-His₆标签融合构建体中均得以实现。从1升培养物中获得100–120 mg变性蛋白，最终获得约10–12 mg活性RBD，证明了我们方法的可行性和效率。