线粒体二硫键中继新底物FAM136A：维持线粒体膜间隙蛋白质稳态与细胞健康的关键守护者

本研究聚焦线粒体膜间隙（IMS）蛋白质稳态机制，发现FAM136A作为线粒体二硫键中继系统的新底物，其通过MIA40介导的氧化折叠机制导入IMS并形成同源二聚体。研究证实FAM136A缺失会导致IMS蛋白质（如HAX1和CLPB）稳定性受损，引发整合应激反应（ISR）并显著削弱细胞增殖能力，揭示了FAM136A在维持线粒体功能与细胞健康中的关键作用。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其功能依赖于精准的蛋白质稳态调控。线粒体膜间隙（intermembrane space, IMS）虽然只占线粒体蛋白质组的不到10%，却承载着呼吸调节、代谢协调和细胞凋亡启动等关键功能。许多IMS蛋白质含有保守的半胱氨酸残基，它们通过形成二硫键来稳定结构、发挥催化功能或感知氧化还原状态。这些蛋白质的导入和折叠主要依赖于一个称为“线粒体二硫键中继”（mitochondrial disulphide relay）的核心 machinery，其核心组分包括氧化还原酶MIA40（又称CHCHD4）、硫醇氧化酶ALR以及具有激活功能的AIFM1。然而，在IMS中仍有大量功能未知的“孤儿”蛋白质，其生物发生机制及生理功能尚不明确，这限制了对线粒体功能与相关疾病机制的全面理解。

为了探索IMS蛋白质组中的未知功能成员，研究人员将目光投向了一个名为FAM136A的蛋白质。该蛋白与梅尼埃病（一种以内耳眩晕、听力波动为特征的慢性疾病）存在遗传关联，但其病理机制和生理功能均不清楚。早期的蛋白质组学研究表明FAM136A定位于IMS，并且其序列中含有多个保守的半胱氨酸残基，提示它可能是一个潜在的二硫键中继系统底物。此外，功能基因组学数据分析显示，FAM136A与已知的IMS稳态网络组分（如HTRA2、CLPB、MTCH2等）存在密切的功能联系，暗示它可能参与维持IMS的蛋白质稳态。

为了验证这一假设，研究团队开展了一系列深入的生物化学和细胞生物学实验。他们首先通过生物信息学分析确认了FAM136A在不同物种中保守的九个半胱氨酸残基，其中八个形成两个典型的双CX₃C motif——这是小TIM伴侣蛋白家族的典型特征。结构预测显示这些半胱氨酸可能形成四对二硫键，稳定蛋白质的三维结构。随后通过细胞分馏、免疫荧光显微镜、线粒体亚分馏和碳酸盐提取实验，研究人员证实FAM136A确实是一个可溶性的IMS蛋白质。

研究的关键发现是FAM136A与二硫键中继系统的直接相互作用。通过直接氧化还原转换实验，研究人员发现细胞内稳态下的FAM136A几乎完全处于氧化状态。共免疫沉淀实验证明FAM136A与MIA40存在瞬时相互作用，这种相互作用在变性条件下仍然存在，表明两者之间形成了共价的二硫键连接。使用翻译抑制剂环己酰亚胺的追踪实验进一步证实这种相互作用的瞬时特性，与其他已知MIA40底物的行为一致。

为了深入理解这种相互作用的机制，研究人员建立了体外重组系统。他们纯化了野生型MIA40及其功能缺失突变体（包括氧化还原失活的MIA40 SPS和分子伴侣功能受损的MIA40 F68E），发现FAM136A与野生型MIA40的相互作用显著强于功能缺失突变体。更重要的是，体外氧化动力学实验直接证明了MIA40能够有效地氧化FAM136A，形成瞬时的MIA40-FAM136A混合二硫键中间体，并最终生成完全氧化的FAM136A单体。

研究人员进一步探讨了FAM136A线粒体导入的机制依赖性。通过细胞器内导入实验，他们发现FAM136A的线粒体导入强烈依赖于MIA40和AIFM1的存在，同时也需要线粒体膜电位的维持。在MIA40敲低或AIFM1敲除细胞中，FAM136A的稳态水平显著降低至野生型的30-50%。有趣的是，虽然MIA40的过表达能够恢复FAM136A的水平，但并不会导致其过度积累，表明MIA40水平对FAM136A的处理是限制性的但并非绝对限制。

对FAM136A半胱氨酸功能的研究揭示了这些残基的关键作用。构建所有九个半胱氨酸都被突变的全丙氨酸变异体（9CA）以及分别突变两个双CX₃C motif的变异体（CA-1和CA-2）后，研究人员发现这些变异体无法正确定位于线粒体，且其蛋白质水平显著降低。此外，FAM136A包含一个推测的MISS/ITS motif（介导与MIA40相互作用的疏水斑块），该区域的突变也损害了蛋白质的线粒体导入。

一个令人惊讶的发现是成熟FAM136A在细胞中以同源二聚体形式存在。凝胶过滤分析和化学交联实验表明内源性FAM136A的分子量约为30kDa，是其单体分子量（15kDa）的两倍。共表达不同标签版本FAM136A的共免疫沉淀实验进一步证实了这种同源二聚化现象。AlphaFold结构预测显示，两个单体的N端区域（氨基酸21-55）形成二聚化界面，通过M32、F33和I54残基之间的疏水相互作用以及R26与D42和A45之间的氢键网络来稳定二聚体结构。

研究人员随后探究了FAM136A缺失的细胞生理学后果。通过CRISPR-Cas9介导的急性基因敲除和siRNA敲低，他们发现FAM136A的缺失导致细胞增殖能力显著下降，这一表型在HAP1细胞中尤为明显。全细胞蛋白质组学分析显示，FAM136A缺失会导致其遗传相互作用伙伴（如HTRA2、HAX1和CLPB）的蛋白质水平显著降低。特别值得注意的是，HAX1和CLPB的水平在FAM136A敲低细胞中下降，而YME1L（一种IMS蛋白酶）的缺失能够恢复HAX1的水平，但同时导致HAX1更容易形成不溶性聚集体。

最重要的发现之一是FAM136A缺失会激活整合应激反应（integrated stress response, ISR）。在FAM136A敲除细胞中，ISR关键转录因子ATF4和CHOP的表达水平显著上调，同时ISR诱导型细胞因子GDF15也明显增加。这种应激反应的激活在HAP1细胞中更为强烈，可能与这些细胞的单倍体特性相关。有趣的是，虽然同时敲除DELE1或HRI（ISR信号通路的关键组分）能够减弱ISR标记物的诱导，但并不改变FAM136A缺失引起的生长缺陷表型，表明这种生长缺陷主要源于线粒体蛋白质稳态的更深层次崩溃，而非ISR激活本身。

本研究综合运用了多种关键技术方法，包括：CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因敲除细胞系；细胞器内蛋白质导入实验分析蛋白质线粒体定位；体外氧化还原动力学实验研究二硫键形成过程；免疫共沉淀和交联实验检测蛋白质相互作用；蛋白质组学分析全局蛋白质表达变化；AlphaFold结构预测模拟蛋白质二聚化界面。所有实验均在HEK293和HAP1细胞系中进行。

FAM136A – a soluble orphan IMS protein with conserved cysteines

研究人员通过生物信息学分析发现，在IMS的未表征蛋白质中，FAM136A含有高度保守的半胱氨酸残基，形成两个双CX₃C motif。细胞分馏、免疫荧光和线粒体亚分馏实验证实FAM136A是一个可溶性IMS蛋白质，缺乏典型的线粒体靶向信号。

FAM136A undergoes oxidation by MIA40 during its maturation

氧化还原状态分析显示稳态下的FAM136A几乎完全处于氧化状态。共免疫沉淀实验证明FAM136A与MIA40存在瞬时的、共价的相互作用。体外实验进一步证实MIA40的氧化还原活性和分子伴侣功能都对这种相互作用至关重要，且MIA40 alone足以催化FAM136A所有二硫键的形成。

FAM136A IMS import and stability depend on the mitochondrial disulphide relay

细胞器内导入实验表明FAM136A的线粒体导入依赖于MIA40、AIFM1和线粒体膜电位。在MIA40敲低或AIFM1敲除细胞中，FAM136A的稳态水平显著降低。过表达功能缺陷的MIA40变异体也会导致FAM136A水平下降。

FAM136A cysteines determine its stability

半胱氨酸突变实验表明这些保守残基对FAM136A的正确线粒体定位和稳定性至关重要。所有半胱氨酸突变体都无法正确定位于线粒体，且其蛋白质水平显著降低。MISS/ITS motif的突变也损害了蛋白质的导入。

FAM136A forms a dimer during its biogenesis

凝胶过滤、交联和共免疫沉淀实验表明成熟FAM136A以同源二聚体形式存在。结构预测显示二聚化界面由N端区域介导，通过疏水相互作用和氢键网络稳定。

Loss of FAM136A results in loss of selected IMS proteins and increased aggregation of the IMS protein HAX1

FAM136A缺失导致细胞增殖能力下降，并引起多个IMS蛋白质（如HAX1和CLPB）水平降低。YME1L缺失能够恢复HAX1水平，但增加其聚集倾向，表明FAM136A具有防止特定蛋白质聚集的功能。

Loss of FAM136A results in ISR induction and impaired cellular fitness

FAM136A缺失强烈激活整合应激反应，上调ATF4、CHOP和GDF15表达。虽然ISR抑制能够减弱应激标记物的诱导，但并不改善生长缺陷表型，表明这种缺陷主要源于线粒体蛋白质稳态的根本性破坏。

本研究系统性地将FAM136A确立为线粒体二硫键中继系统的一个新底物，扩展了我们对这一关键蛋白质导入通路底物谱的认识。研究发现FAM136A通过MIA40介导的氧化折叠机制导入IMS，形成二硫键稳定的同源二聚体，这一过程对其在线粒体内的积累和稳定性至关重要。更重要的是，FAM136A在维持IMS蛋白质稳态中扮演着关键角色，其缺失会导致特定IMS蛋白质（如HAX1和CLPB）的不稳定和聚集，进而引发整合应激反应并显著损害细胞增殖能力。

这些发现不仅揭示了FAM136A的生物学功能，也为理解线粒体蛋白质稳态网络的复杂性提供了新的视角。从转化医学角度，FAM136A与梅尼埃病的遗传关联提示其可能在线粒体相关疾病中发挥作用，而其缺失引起的ISR激活也为理解细胞应激反应机制提供了新的线索。值得注意的是，虽然人群中FAM136A功能缺失变异似乎能够被耐受，但急性缺失却引起显著的细胞表型，这种差异可能反映了细胞在慢性条件下的适应机制。

总体而言，这项研究将FAM136A定位为线粒体蛋白质稳态网络的一个关键组成部分，通过其对特定IMS蛋白质稳定性的影响，在维持线粒体功能和整体细胞健康中发挥着守护者般的作用。这些发现不仅增进了我们对线粒体生物学的基本理解，也可能为相关疾病的机制研究和治疗策略开发提供新的思路。论文发表在《Redox Biology》上，强调了氧化还原过程在这一机制中的核心地位。