KEAP1 BTB结构域传感器活性的双向调控机制解析

本研究针对KEAP1-CUL3泛素连接酶中BTB结构域感知电泳化学物质的分子机制尚不明确的问题，通过共晶结构分析和功能实验，揭示了Cys151修饰通过改变BTB同源二聚体空间构象双向调控KEAP1-CUL3复合物活性的新机制。该发现为开发靶向KEAP1-NRF2通路的 therapeutics 提供了结构基础，论文发表于《Redox Biology》。

　　

在细胞应对氧化应激的过程中，KEAP1-CUL3泛素连接酶扮演着至关重要的角色。它通过调控转录因子NRF2的稳定性，主导着细胞防御基因的表达。KEAP1蛋白的BTB结构域中，一个名为Cys151的氨基酸残基被确认为感知亲电化学物质的主要传感器。当亲电试剂（如环境毒素或某些药物分子）与Cys151结合后，会抑制KEAP1对NRF2的泛素化降解，从而激活细胞的保护性应答。然而，一个长期困扰科学家们的核心问题是：简单的Cys151化学修饰，是如何精确地调控庞大的KEAP1-CUL3泛素连接酶复合物的活性？其背后的结构生物学机制一直是个未解之谜。为了解决这一难题，由日本东北大学的Suzuki、Yamamoto等领导的研究团队在《Redox Biology》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员综合运用了X射线晶体学、蛋白质生物化学、细胞生物学以及人工智能结构预测（AlphaFold3）等多种技术手段。他们首先解析了小鼠KEAP1 BTB结构域（氨基酸50-179，含S172A突变）的apo形式（未结合配体）晶体结构。随后，他们成功获得了BTB结构域与两种强效NRF2诱导剂——CDDO-Im和CDDO-Me的共晶结构。为了验证结构观察到的现象，研究团队在Keap1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中稳定表达了野生型KEAP1及其关键位点突变体（如Y85F, C151S），并通过免疫印迹和实时荧光定量PCR分析了NRF2蛋白水平及其下游靶基因（如Nqo1, Gclc）的表达。此外，他们还利用体外pull-down实验定量分析了不同小分子化合物处理后，全长KEAP1与CUL3 N端结构域（CUL3^NTD）之间的相互作用变化。

结构分析揭示了BTB同源二聚体的精细构象

研究团队发现，小鼠KEAP1 BTB结构域形成同源二聚体，其结构与人类同源物高度相似。该结构由一个三链β-折叠和六个α-螺旋组成。特别值得注意的是，二聚体中两个单体的β1链（51-55位氨基酸）和β5链（144-147位氨基酸）之间形成了一个反平行β-折叠片层（研究中称为Part 3区域），这个区域靠近与CUL3相互作用的界面。

CDDO-Im独特地交联Cys151和Tyr85

对CDDO-Im复合物的结构分析揭示了一个意想不到的发现：CDDO-Im的分子同时与Cys151和Tyr85共价结合，在这两个残基之间形成了一个“分子桥”或交联。这种双位点结合模式是CDDO-Im所特有的，因为其他CDDO家族成员（如CDDO和CDDO-Me）仅与Cys151结合。功能实验表明，虽然Tyr85的羟基对维持KEAP1在基础状态下降解NRF2的活性很重要（Y85F突变导致基础NRF2水平升高），但它对于CDDO-Im诱导的NRF2激活并非必需。

Cys151修饰引发BTB二聚体构象变化并削弱KEAP1-CUL3相互作用

深入的结构比较表明，无论是CDDO-Im还是其他仅修饰Cys151的CDDO化合物，其结合都会引发BTB二聚体Part 3区域的构象变化。这种变化虽然在一个单体内部看起来很微小，但当固定二聚体中一个单体的CUL3结合区域进行结构叠合时，可以观察到另一个单体螺旋α6（163-178）发生了明显的空间位移。研究人员推测，这种二聚体水平的构象重排会影响到与CUL3 N端（CUL3^NTD）直接相互界的BTB区域（特别是40-43位氨基酸形成的β-片层）。体外pull-down实验有力地支持了这一假设：CDDO-Im、CDDO、CDDO-Me以及已获批药物Omaveloxolone（RTA-408）都能将野生型KEAP1与CUL3^NTD的结合能力降低约50%，而这种抑制作用完全依赖于Cys151的存在（C151S突变体不受影响）。这一结果符合“一个KEAP1二聚体结合两个CUL3分子”的模型，提示亲电修饰导致了一个CUL3分子的解离。

KEAP1激活剂诱导相反的构象变化

为了验证BTB二聚体构象变化与功能调控的直接关联，研究人员分析了KEAP1激活剂（即NRF2抑制剂）VVD-065的作用。VVD-065同样靶向Cys151，但其功能是增强KEAP1的泛素连接酶活性。结构分析显示，VVD-065诱导的BTB二聚体构象变化，其方向与CDDO化合物诱导的变化完全相反。此外，通过AlphaFold3预测的模型表明，其他Cys151偏好性NRF2诱导剂（如萝卜硫素SFN、叔丁基对苯二酚tBHQ、富马酸二甲酯DMF）也引起了与CDDO化合物方向相同的构象变化，只是程度较弱。

本研究最终提出了一个名为“B-DASHR”的创新模型，即BTB二聚体构象变化双向调控应答模型。该模型阐明，KEAP1 BTB结构域中的Cys151传感器能够通过感知不同的亲电化合物，引发BTB同源二聚体发生方向相反的构象变化。当NRF2诱导剂（如CDDO家族）结合时，二聚体构象向一个方向改变，削弱KEAP1与CUL3的亲和力，从而稳定NRF2并激活细胞保护程序。相反，当KEAP1激活剂（如VVD-065）结合时，二聚体构象向相反方向改变，增强了KEAP1-CUL3的泛素化活性，促进NRF2的降解。这一发现不仅揭示了KEAP1作为精密分子传感器的双向调控机制，为理解细胞氧化应激应答的精细调控提供了全新的结构基础，也为未来开发靶向KEAP1-NRF2通路的新型治疗药物（无论是用于增强抗氧化能力的NRF2激活剂，还是用于治疗NRF2过度活化相关疾病的NRF2抑制剂）开辟了基于结构的合理化设计道路。