Keap1/Nrf2轴通过非经典代谢调控通路调控成年肌肉干细胞静息与早期激活的性别特异性机制

《Nature Communications》：Non-canonical roles of Keap1/Nrf2 in regulating quiescence and early activation in adult muscle stem cells

本研究针对成年肌肉干细胞(MuSCs)静息维持机制不明确的问题，揭示了Keap1/Nrf2轴通过非抗氧化应激的代谢调控新机制调控MuSCs静息维持。研究人员通过诱导性基因敲除模型发现，Keap1缺失导致Nrf2蛋白积累，且雌激素通过抑制GSK3β进一步稳定Nrf2，促使MuSCs发生代谢重编程和自发激活。该研究阐明了Keap1/Nrf2在干细胞静息调控中的非经典功能，为理解肌肉再生障碍提供了新视角。

　　

在成年哺乳动物骨骼肌中，肌肉干细胞(MuSCs)通常处于静息状态，只有在肌肉损伤时才会被激活并参与修复过程。这种静息状态的精细调控对维持干细胞池的稳定至关重要。尽管已有研究发现Notch通路、Pten/FoxO通路等参与这一过程，但我们对MuSCs静息维持机制的理解仍不完整。特别是，氧化还原调控是否在MuSCs静息维持中发挥作用，一直是个未解之谜。

Keap1/Nrf2轴是细胞抗氧化应激的核心通路，在癌细胞中研究较为深入，但在体细胞干细胞中的功能尚不明确。传统观点认为，在无氧化应激条件下，Keap1作为接头蛋白促进Nrf2的泛素化降解；而在氧化应激时，Nrf2稳定并进入细胞核激活抗氧化基因表达。然而，这一经典通路在肌肉干细胞中是否发挥非抗氧化功能，成为了本研究探索的重点。

为了回答这一问题，香港科技大学吴振国教授团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，揭示了Keap1/Nrf2在调控成年肌肉干细胞静息与早期激活中的非经典角色。

研究人员首先构建了他莫昔芬(TMX)诱导的肌肉干细胞特异性Keap1敲除小鼠模型(Keap1 cKO)，并利用心脏毒素(CTX)诱导的肌肉损伤模型评估Keap1缺失对肌肉再生的影响。研究发现，Keap1缺失显著损害了肌肉再生能力，表现为再生肌纤维数量减少和纤维横截面积减小。

令人意外的是，Keap1缺失对MuSCs静息维持的影响表现出明显的性别差异。在雌性小鼠中，Keap1缺失导致MuSCs数量随时间逐渐减少，而在雄性小鼠中则无此现象。通过体内EdU标记实验，研究人员发现雌性Keap1 cKO小鼠的MuSCs自发退出静息状态并进入细胞周期，而雄性突变小鼠的MuSCs则保持相对稳定。

转录组分析显示，Keap1缺失引起的基因表达变化在雌雄小鼠中存在显著差异。雌性Keap1缺失MuSCs中更多基因表达发生改变，且"mTORC1信号"通路在两种性别的突变细胞中均被激活，表明MuSCs处于更活跃的状态。

机制上，研究人员发现Keap1通过调控Nrf2蛋白降解来维持MuSCs静息。在野生型MuSCs中，Nrf2蛋白水平极低，而Keap1缺失导致Nrf2积累，且在雌性小鼠中积累程度最高。这种差异源于雌激素对GSK3β活性的抑制：在雌性小鼠中，较高的雌激素水平使GSK3β磷酸化(失活形式)增加，从而减弱了GSK3β-β-TrCP-Cul1介导的Nrf2降解通路。

为了验证高水平Nrf2是导致MuSCs自发激活的原因，研究人员构建了Keap1/Nrf2双敲除小鼠(dKO)。实验表明，同时敲除Nrf2可以挽救Keap1缺失引起的MuSCs数量减少和自发激活，证实了Nrf2在此过程中的关键作用。

雌激素进一步以GSK3β依赖但Keap1非依赖的方式稳定Nrf2。研究人员通过卵巢切除降低雌性小鼠雌激素水平，发现可以降低Keap1缺失MuSCs中的Nrf2蛋白水平并挽救MuSCs损失。相反，在去势雄性小鼠中植入17β-雌二醇缓释颗粒，可增加Nrf2蛋白水平并促进MuSCs丢失。

那么，高水平的Nrf2是如何促进MuSCs激活的呢？与传统的抗氧化功能不同，研究人员发现Nrf2通过诱导代谢重编程驱动MuSCs早期激活。基因本体(GO)分析显示，"戊糖磷酸途径"、"NADPH生成"和"谷胱甘肽代谢过程"等代谢相关术语在雌性Keap1缺失MuSCs中富集。

染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析证实，Nrf2直接结合到多个代谢基因的增强子区域，包括G6pdx(编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)和Gclc(编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基)。报告基因实验进一步验证了这些区域的增强子活性依赖于Nrf2。

功能上，抑制G6pdx或Gclc活性可显著损害MuSCs的早期激活。研究人员利用CRISPR/Cas9技术在幼年小鼠肌肉前体细胞中降低G6pdx或Gclc表达，发现这确实损害了MuSCs的早期激活能力。

本研究主要采用了以下关键技术方法：他莫昔芬诱导的肌肉干细胞特异性基因敲除小鼠模型、心脏毒素诱导的肌肉损伤再生模型、荧光激活细胞分选(FACS)分离肌肉干细胞、RNA测序(RNA-seq)分析转录组、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析转录因子结合、体内外EdU标记检测细胞增殖、蛋白质印迹(Western blot)分析蛋白表达、以及AAV9介导的CRISPR/Cas9基因编辑等。

Keap1调节MuSCs静息维持通过抑制Nrf2蛋白积累

研究表明，Keap1通过促进Nrf2蛋白降解来维持MuSCs静息。Keap1缺失导致Nrf2积累，且在雌性小鼠中积累程度最高，引发MuSCs自发激活。

雌激素以GSK3β依赖方式进一步稳定Nrf2

研究发现雌激素通过抑制GSK3β活性来稳定Nrf2。雌性小鼠中较高的雌激素水平使GSK3β磷酸化增加，减弱了GSK3β介导的Nrf2降解，导致Nrf2进一步积累。

高水平Nrf2在Keap1缺失的雌性小鼠MuSCs中转录诱导多种代谢基因

高水平的Nrf2不是通过抗氧化功能，而是通过诱导代谢重编程来促进MuSCs激活。Nrf2直接结合到代谢基因(如G6pdx和Gclc)的增强子区域，上调其表达。

Nrf2诱导的G6pdx和Gclc表达对MuSCs体外和体内早期激活是必需的

功能实验表明，抑制G6pdx或Gclc活性可损害MuSCs早期激活。CRISPR/Cas9介导的基因敲低证实了这些代谢酶在MuSCs激活中的关键作用。

该研究揭示了Keap1/Nrf2轴在调控成年肌肉干细胞静息与早期激活中的非经典功能。在静息期，高水平的Keap1通过蛋白酶体依赖的Nrf2降解维持MuSCs静息；在早期激活期，Keap1下调导致Nrf2稳定，进而促进MuSCs激活和细胞周期重新进入。重要的是，这种调控具有性别特异性：在雌性小鼠中，高水平的雌激素通过抑制GSK3β进一步稳定Nrf2，导致代谢重编程和自发静息退出。

这一发现不仅深化了我们对肌肉干细胞生物学行为的理解，也为肌肉再生障碍相关疾病提供了新的治疗靶点。未来研究可探讨衰老或某些病理条件是否通过破坏Keap1/Nrf2轴而损害肌肉干细胞功能。