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为探究 RAB22A 介导的非经典自噬体形成机制，中山大学肿瘤防治中心研究人员开展了分泌性内质网自噬（ER-phagy）通路研究。结果发现 RAB22A/TMEM33/RTN4 组装启动该通路，促进相关物质分泌。这为研究细胞物质分泌提供新视角。
在细胞的微观世界里，自噬就像一位勤劳的 “清道夫”，负责清理细胞内多余的物质和受损的细胞器，对维持细胞的正常功能起着至关重要的作用。其中，一种名为 Rafeesome 的特殊结构，是由 RAB22A 介导的内质网（ER）来源的非经典自噬体与 RAB22A 阳性早期内体融合形成的，它在细胞物质的分泌过程中扮演着重要角色。然而，RAB22A 介导的非经典自噬体究竟是如何形成的，这一问题一直困扰着科学家们。与此同时，内质网作为细胞内重要的细胞器，其与自噬体形成之间的关系也尚不明确，比如内质网的具体亚结构域是如何参与吞噬泡形成的，以及内质网的形态与自噬机制之间存在着怎样的联系等。这些未解之谜就像层层迷雾，笼罩着细胞生物学领域，亟待科学家们去揭开它们的神秘面纱。
为了攻克这些难题，中山大学肿瘤防治中心的研究人员勇挑重担，开展了一项深入的研究。他们把目光聚焦在分泌性内质网自噬通路的探索上，试图找到 RAB22A 介导的非经典自噬体形成的关键机制。经过一系列严谨而细致的实验，研究人员取得了重大突破。他们发现了一条全新的分泌性内质网自噬通路，即 RAB22A/TMEM33/RTN4 的组装能够引发内质网重塑，进而推动 RTN4 阳性非经典自噬体的形成，这些自噬体最终会通过 Rafeesome - R - EVs（RAB22A 诱导的细胞外囊泡）途径被分泌到细胞外。这一发现意义非凡，它不仅为我们理解细胞内物质的分泌机制提供了全新的视角，还揭示了内质网自噬与细胞外囊泡之间的紧密联系，为相关疾病的研究和治疗开辟了新的方向。该研究成果发表在《Cell Discovery》杂志上，引起了学术界的广泛关注。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是亚细胞器分离结合质谱分析技术，用于鉴定参与 RAB22A 介导的非经典自噬体形成的关键分子；其次是免疫荧光、免疫印迹、免疫沉淀等技术，以探究相关蛋白之间的相互作用、定位及表达水平变化；此外，还利用了超分辨率显微镜成像技术（如 SIM、3D - STORM）和活细胞成像技术，直观地观察细胞内结构和动态过程。
下面让我们详细了解一下研究结果：
- TMEM33 和 RTN4B 在内质网来源的非经典自噬体中富集：研究人员通过亚细胞器分离方法沉淀 Rafeesomes，并进行质谱分析，发现 TMEM33 与 LC3 - II 共定位且在内质网来源的非经典自噬体中富集。同时，RTN4B 也与 LC3 - II 共定位，且内源性 TMEM33 和 RTN4B 在 Rafeesomes 中共同富集，这表明它们可能参与了 RAB22A 介导的内质网来源的非经典自噬过程。
- TMEM33 和 RTN4 是 RAB22A 介导的非经典自噬所必需的：过表达 TMEM33 或 RTN4B 会增加 LC3 - II 水平，而敲低它们则会降低基础 LC3 - II 水平。体外 LC3 脂化实验也证实，TMEM33 或 RTN4B 的表达能促进 LC3 转化。此外，敲低 TMEM33 或 RTN4B 会损害 RAB22A 介导的非经典自噬和 Rafeesomes 的形成，以及 LC3 - II 分泌到 R - EVs 中，说明 RAB22A 介导的内质网来源的分泌性自噬依赖于 TMEM33 和 RTN4。
- TMEM33 是 RAB22A 介导的分泌性自噬的标志物：研究设计了免疫亲和方法，发现 calnexin、RTN4B 和 LC3 - II 在 TMEM33 标记的 R - EVs 中富集，而在经典外泌体中不存在，且 TMEM33 标记的 R - EVs 与经典外泌体大小不同，这表明 TMEM33 阳性 R - EVs 代表了一类特殊的细胞外囊泡群体，确立了 TMEM33 作为 RAB22A 介导的分泌性自噬标志物的地位。
- RAB22A 和 TMEM33 促进 RTN4 寡聚化形成 RTN4 聚集体：RAB22A 和 TMEM33 能够促进 RTN4B 聚集体的形成，且 RTN4B 聚集体会被 RAB22A 阳性早期内体吞噬形成 Rafeesomes。同时，研究发现 RAB22A、TMEM33 能增强 RTN4 寡聚化，而敲低 TMEM33 或 RAB22A 则会减少 RTN4B 寡聚化，表明它们协同促进 RTN4 簇富集微结构域的形成，进而形成 RTN4 聚集体。
- RTN4 的 TM2 结构域对其寡聚化及与 TMEM33 的相互作用至关重要：构建 RTN4B 截断突变体研究发现，删除其 RHD 结构域内的氨基酸 221 - 314 或 TM2 结构域（315 - 335）会显著降低寡聚化 RTN4B 的量，且 TM2 结构域对 RTN4B 与 TMEM33 的相互作用至关重要，同时 TMEM33 的第一个跨膜结构域对其与 RTN4B 的相互作用也必不可少。
- RTN4 囊泡是 RAB22A 介导的非经典自噬体的前体：研究观察到较大的 RTN4B - mCherry 聚集体与 LC3 - II 共定位，且其大小与 RAB22A 介导的非经典自噬体相似。删除 ATG16L1 或 ATG5 会显著消除较大聚集体的形成，而对较小聚集体无影响。通过多种显微镜技术观察到 RTN4 微结构域会形成囊泡结构，推测这些 RTN4 囊泡可能是 RAB22A 介导的非经典自噬体的前体膜，较大的 RTN4 聚集体被命名为 RTN4 非经典自噬体。
- TMEM33 促进 RTN4 非经典自噬体的形成：敲低 TMEM33 会减少 RTN4B - mCherry 囊泡的数量，而过表达 TMEM33 则能增强内源性 RTN4B 非经典自噬体的形成。体外膜融合实验证实 RTN4 非经典自噬体能与早期内体融合形成 Rafeesomes，且 RAB22A 能防止 RTN4 非经典自噬体与溶酶体融合，使其最终通过 Rafeesomes 分泌为 R - EVs。
- ATG9A 运输 RTN4 囊泡促进 RTN4 非经典自噬体的形成：敲低 ATG9A 会导致 RTN4B - mCherry 非经典自噬体数量减少，同时 RTN4B - mCherry 囊泡积累。GFP - ATG9A 与 mCherry 标记的 RTN4B 囊泡及非经典自噬体共定位，表明 ATG9A 在运输 RTN4 囊泡、促进 RTN4 非经典自噬体形成及后续内质网成分分泌到 R - EVs 中发挥重要作用。
研究结论表明，RAB22A/TMEM33/RTN4 组装启动了一条分泌性内质网自噬通路，该通路驱动了 RTN4 非经典自噬体的形成，这些自噬体将内质网来源的底物包装并通过 Rafeesome - R - EV 途径分泌到细胞外。在讨论部分，研究人员指出，这一发现不仅揭示了一种新的非经典自噬诱导机制，还发现了 RTN4 驱动的分泌性内质网自噬通路，为细胞清除内质网部分和调节内质网周转提供了新的策略。此外，该研究还揭示了内质网自噬与分泌性自噬之间的紧密联系，为内质网货物的分泌提供了新的见解，为后续相关领域的研究奠定了坚实的基础，有望推动细胞生物学和医学领域的进一步发展。
