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为探究植物体细胞胚胎发生（SE）过程中磷酸化修饰的奥秘，山东农业大学研究人员对棉花 SE 不同阶段进行磷酸化蛋白质组学分析。结果发现大量磷酸化位点和蛋白，明确其功能及动态变化。该研究为植物再生机制提供依据，助力作物育种。
在植物的奇妙世界里，细胞就像一个个充满魔力的小工厂，它们蕴含着惊人的潜力。植物细胞的全能性，使得一个小小的细胞有可能发育成一株完整的植物，这一过程中的体细胞胚胎发生（SE）更是植物繁殖和遗传改良的关键环节。然而，目前人们对于 SE 过程中蛋白质磷酸化修饰的情况却知之甚少。蛋白质磷酸化作为一种常见的翻译后修饰，参与调控众多细胞信号转导事件，对植物生长发育起着至关重要的作用。在 SE 过程中，蛋白质磷酸化究竟如何发挥作用，哪些蛋白和位点参与其中，这些问题都亟待解决。为了揭开这些谜团，山东农业大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《BMC Biology》杂志上。
研究人员运用了一系列先进的技术方法来开展此项研究。他们首先选取棉花（Gossypium hirsutum L.）作为研究对象，对棉花 SE 的三个典型发育阶段，即非胚性愈伤组织（NEC）、初级胚性愈伤组织（PEC）和球形胚（GE）进行样本采集。接着，通过蛋白质提取、胰蛋白酶消化，然后利用串联质谱标签（TMT）标记、高效液相色谱（HPLC）分级分离以及磷酸化肽段富集等技术处理样本。之后，采用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析和数据库检索来鉴定和定量蛋白质及磷酸化位点。同时，运用生物信息学工具，如 WoLF PSORT 预测亚细胞定位、Motif - x 分析序列模式，以及进行层次聚类分析（HCA）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析、蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络分析等，对数据进行深入挖掘。
研究人员构建了植物再生起始阶段的磷酸化蛋白质组景观。通过对样本的分析，他们共鉴定出 6301 个可量化的磷酸化位点，涉及 2627 个可量化的磷酸化蛋白。这些数据为后续研究提供了全面的磷酸化蛋白质组数据集。
对磷酸化位点和磷酸化蛋白的特性进行探究。研究发现，磷酸化位点周围的氨基酸分布存在显著偏差，如天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（E）等七种氨基酸在磷酸化位点周围区域过度表达。在单个磷酸化蛋白中，磷酸化位点数量差异较大，多数蛋白磷酸化位点较少，但少数蛋白有超过六个磷酸化位点。从磷酸化氨基酸残基来看，丝氨酸（pSer）磷酸化占比最高，表明其在调节植物再生过程中蛋白质功能方面起关键作用。此外，多数磷酸化蛋白分布在细胞核、叶绿体、细胞质和质膜等亚细胞结构中。
在 SE 过程中，研究人员鉴定出差异调节磷酸化蛋白（DRPPs）。通过对 NEC、PEC 和 GE 样本的两两比较，共发现 1105 个 DRPPs，这些蛋白在 SE 过程中呈现出不同的上调和下调模式。GO 和 KEGG 富集分析表明，在愈伤组织胚性分化（PEC vs. NEC）阶段，DRPPs 主要富集在核酸代谢和 DNA 复制、错配修复等通路；在体细胞胚胎起始（GE vs. PEC）阶段，DRPPs 则在响应无机物质、氯化物运输以及过氧化物酶体和光合作用相关通路中显著富集。
通过对 DRPPs 进行动态轨迹分析，研究人员观察到在植物再生起始阶段，DRPPs 在不同发育阶段呈现出六种动态模式。例如，在 PEC 阶段，某些蛋白在簇 2、4、5 中呈现出特征性模式，簇 2 中的丝氨酸 / 精氨酸重复基质蛋白 1 样蛋白磷酸化程度高，可能参与复杂的调控网络；簇 5 则显著富集植物激素信号转导等通路。在 GE 阶段，不同簇的蛋白分别在光合作用、基因表达和跨膜运输等过程中发挥作用。
研究人员还构建了 SE 过程中磷酸化蛋白的 PPI 网络。在不同比较组中，如 PEC vs. NEC、GE vs. PEC 和 GE vs. NEC，分别鉴定出不同数量的 DRPPs 相互作用簇，这些簇涉及剪接体、mRNA 监测通路等多种生物学过程。
在讨论部分，研究人员指出，植物体细胞胚胎发生在植物生物技术和作物育种中具有重要意义，但目前其低频率和高畸形胚率限制了应用。本研究鉴定出的 DRPPs 可能是 SE 的关键调节因子，为提高 SE 效率提供了潜在靶点。例如，细胞周期蛋白依赖性激酶（CKI）磷酸化位点的上调可能促进棉花再生，DNA 修复和过氧化物酶体生物发生相关蛋白的差异调节对维持基因组稳定性和代谢稳态至关重要。同时，研究中发现的多种蛋白激酶和转录相关磷酸化蛋白，为进一步研究植物再生的分子机制提供了方向。然而，还需要通过突变体、CRISPR/Cas9 基因编辑等方法进一步验证这些蛋白和位点的功能。
总之，该研究全面解析了棉花体细胞胚胎发生过程中的磷酸化蛋白质组景观，揭示了关键的磷酸化蛋白和事件，为理解植物细胞全能性和再生的分子机制提供了重要依据，也为作物改良提供了潜在的靶点，对推动植物细胞工程和作物育种发展具有重要意义。
