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遗传变异与人类疾病关系研究面临挑战，为破难题，研究人员开展活细菌酶检测技术（LEICA）相关研究。结果显示，该技术可精准反映人类酶活性，用于疾病突变筛查与药物筛选。其意义重大，为精准医学发展助力。
在生命科学的宏大版图中，遗传变异与人类疾病之间的神秘联系一直是科学家们不懈探索的焦点。随着高通量测序技术的蓬勃发展，海量的遗传变异信息被挖掘出来，就像打开了一个装满宝藏的宝箱。然而，想要弄清楚这些遗传变异究竟在人类疾病中扮演着怎样的角色，却困难重重。
传统的研究方法存在诸多局限。以往，鉴定与遗传疾病相关的基因型，主要依赖直接的患者分析和病例报告。一旦确定了与特定疾病相关的遗传变异，后续的研究方法也问题不少。体外研究使用患者来源的材料或重组蛋白来表征突变蛋白，可样本获取困难，纯化过程繁琐又费力，还常常需要为不同的蛋白质量身定制专门的检测系统，分析方法和仪器也耗时耗力。而且，体外环境与体内真实的生理环境差异巨大，难以模拟细胞内拥挤且呈凝胶状的环境，这就使得体外检测结果的准确性大打折扣 。大规模的计算调查，比如基于群体测序数据集的全基因组关联研究，虽然能找到遗传变化和病理状况之间的潜在关联，但却无法确定因果关系，毕竟还有许多未被充分研究的变异，以及诸如合子状态和遗传连锁等混杂因素的干扰。另外，那些在早期就会引发严重致病性的变异在人群中极为罕见，很难获取相关样本，在人群数据库中也难以检测到，这就导致致病性突变常常难以被发现，而检测到的突变对酶活性的影响又可能微乎其微。
为了攻克这些难题，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校（University of California San Diego）的研究人员 Donghui Choe 和 Bernhard O. Palsson 展开了深入研究。他们另辟蹊径，开发出了一种活细菌酶检测技术（Live Bacteria Enzyme Assay，LEICA），相关研究成果发表在《Nature Biomedical Engineering》上。这一研究成果意义非凡，为人类遗传酶病的研究以及药物筛选开辟了新的道路，有望推动精准医学的发展。
研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。在构建菌株方面，通过 lambda 重组技术对大肠杆菌（E. coli）进行基因编辑，构建了一系列基因敲除和人源化的大肠杆菌菌株，以此来研究不同基因的功能 。在基因克隆与构建方面，利用 Gibson 组装和重叠延伸 PCR（OE PCR）技术，成功构建了包含不同突变的人源基因，并将其导入大肠杆菌中 。在检测分析方面，借助酶标仪监测大肠杆菌的生长曲线，以此来评估酶的活性；采用统计分析方法，如双侧 Welch's t 检验和拟合希尔曲线，来分析数据、比较差异以及计算半最大效应浓度（EC50）和半最大抑制浓度（IC50） 。
生长的大肠杆菌与人 GPI 反映酶活性
研究人员推测，用人类的糖酵解酶替换大肠杆菌中的同源酶，或许能反映人类酶的活性。于是，他们以葡萄糖 - 6 - 磷酸异构酶（GPI）为切入点进行研究。通过敲除 zwf 基因，使大肠杆菌 20.71 菌株（一种经过适应性进化的大肠杆菌 K - 12 MG1655 菌株）中表达人源 GPI 的菌株在含葡萄糖培养基中的生长完全依赖于 GPI 活性。研究人员选取了 6 种与溶血性贫血相关的 GPI 突变，其中包括 2 种良性突变和 4 种致病性突变。实验结果显示，表达不同 GPI 变体的菌株生长速率相较于野生型（WT）对照有明显变化，携带致病性突变的菌株生长速率显著低于 WT GPI，而良性突变菌株的生长速率要么略有下降，要么与 WT 对照无明显差异。进一步对比重组突变体的生化特性和活细菌检测结果，发现酶活性与生长速率之间存在高度线性相关，这充分证明了 LEICA 技术能够有效推断人类酶的活性。
G6PD 相关研究
葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是全球范围内最常见的红细胞酶病，影响着数亿人。研究人员首先验证了人源 G6PD 在大肠杆菌中能够功能性表达。随后，他们挑选了 13 种与不同严重程度的 G6PD 缺乏症相关的序列变异进行研究。结果发现，表达不同 G6PD 变体的菌株生长情况与 WT 酶存在显著差异，比如携带 G6PD - Volendam（一种与慢性溶血相关的 I 类 G6PD 变体）的菌株生长速率仅为 WT 表达菌株的一半。而且，不同 G6PD 变体的生长速率与相应重组酶的生化特性也呈现出线性相关。研究人员还利用 LEICA 技术对一些生化特性未被充分研究的变体进行了检测，发现一些预测为良性的变体生长速率略有下降，暗示酶活性有轻微降低；而 G6PD - Sumare 变体生长明显受限，这表明它可能与疾病存在关联。此外，研究人员还使用 G6PD 激活剂 AG1 进行实验，结果显示 AG1 能够提高表达 WT G6PD 和 G6PD - Canton 变体菌株的生长速率，这进一步证明了 LEICA 技术在检测小分子对酶活性影响方面的有效性。
药物筛选研究
鉴于 LEICA 技术在检测酶活性方面的优势，研究人员尝试用它来筛选各种针对 G6PD 的化合物。他们选取了 7 种已知对 G6PD 有影响的化合物进行筛选，结果发现，LEICA 技术能够准确检测出化合物对人源 G6PD 的抑制作用，与先前的研究结果相符。在筛选一个包含 160 种人类代谢调节剂的药物库时，研究人员发现了 7 种主要命中化合物，其中重新发现了 3 种已知具有 G6PD 抑制作用或抗疟活性的化合物，还有 4 种此前未被报道与 G6PD 活性相关的化合物，其中 3 种对表达人源 G6PD 的大肠杆菌生长有显著抑制作用，这表明它们有可能成为抗疟药物的候选先导化合物，充分展示了 LEICA 技术在药物筛选方面的巨大潜力。
拓展 LEICA 用于筛选人 ASL
为了拓宽 LEICA 技术的应用范围，研究人员将目光投向了精氨酸琥珀酸裂解酶（ASL），它是尿素循环中的关键酶。虽然大肠杆菌本身没有完整的尿素循环，但 argH 基因编码的 ASL 酶参与精氨酸的生物合成。敲除 argH 基因会使大肠杆菌产生精氨酸营养缺陷型，研究人员发现人源 ASL 能够互补这种缺陷，表明人源 ASL 在大肠杆菌中成功实现了功能性表达。研究人员检测了多种已知会导致精氨酸琥珀酸尿症的 ASL 序列变体，结果发现，携带不同致病性 ASL 变体的人源化大肠杆菌在精氨酸合成方面存在显著差异，其生长速率与重组 ASL 变体的残留活性密切相关，这进一步证明了 LEICA 技术在研究不同代谢途径酶方面的通用性。
在讨论部分，研究人员指出，LEICA 技术为研究遗传酶病和药物筛选提供了一种全新的、高效的方法。它巧妙地利用细菌代谢，将细菌生长与酶活性紧密联系起来，能够快速地对与酶缺陷相关的遗传变异进行表征。与传统的体外检测方法相比，LEICA 技术更为简单、经济，还能有效避免传统方法的一些弊端，比如样本获取困难和体外环境不真实等问题。同时，LEICA 技术在药物筛选方面也展现出了独特的优势，能够直接在细胞内环境中评估化合物对酶活性的影响，填补了体外检测和基于细胞检测之间的空白。
当然，LEICA 技术也并非完美无缺。它无法筛选具有抗菌特性的化合物，而且细菌细胞与人类细胞对化学化合物的通透性存在差异，这可能会影响对药物在人体细胞中疗效的准确评估。不过，通过对人源化大肠杆菌和携带内源性细菌基因菌株进行成对比较，可以有效避免假阳性结果。并且，大肠杆菌对小分子（<600 Da）具有非选择性通透性，而且 LEICA 技术在药物库筛选中成功鉴定出 7 种有效化合物，这些都充分证明了它作为一种筛选工具的可靠性。
总体而言，这项研究开发的 LEICA 技术为生命科学和医学研究带来了新的曙光。它在研究遗传变异的功能后果、快速筛选药物库方面表现卓越，为精准医学的发展提供了有力的支持。随着相关研究的不断深入和技术的持续创新，有望进一步推动人类对遗传疾病的理解和治疗，开发出更多针对性的药物，造福广大患者。
