揭秘拟南芥免疫防线：ER-PM 系链 Syt1 调控胞间连通性的关键机制

本文揭示了拟南芥内质网 - 质膜（ER-PM）系链 Synaptotagmin 1（Syt1）在先天免疫反应中的重要作用。Syt1 感知病原体相关分子模式（MAMPs）刺激，通过招募 ANN4 调节质外体（PD）的 Ca2+信号，引发胼胝质依赖的 PD 关闭，限制细菌感染扩散，为植物免疫研究提供新视角。

　　

研究背景

植物抵御病原体依赖细胞自主和非细胞自主免疫系统。细胞自主免疫系统包含模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI） 。PTI 由细胞表面受体识别病原体相关分子模式（MAMPs）启动，激活一系列免疫反应，如胞质钙爆发、活性氧（ROS）产生、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和钙依赖蛋白激酶激活、免疫相关基因转录调控以及质外体胼胝质沉积等。病原体为逃避宿主免疫，会分泌效应子，部分被细胞内抗性（R）蛋白识别，引发 ETI。非细胞自主免疫系统则通过感染细胞向未感染细胞传递信号来应对病原体，其中质外体途径在很大程度上依赖质外体（PD）。PD 直接连接相邻细胞的质膜（PM）、内质网（ER）和细胞质，其孔径大小由 β-1,3 - 葡聚糖（即胼胝质）的沉积和降解动态控制，决定了 PD 的通透性。病原体攻击时，植物关闭 PD 限制细胞间通讯，这是一种先天免疫反应。此前研究已探索了不同免疫激发子触发 PD 关闭的机制，但 MAMP 诱导 PD 关闭的信号级联和分子机制仍有待深入研究。拟南芥中的 Synaptotagmin 1（Syt1）是 ER-PM 接触位点（EPCSs）的分子桥，已有研究表明其参与 PD 通透性调节，然而 Syt1 在植物先天免疫中通过 PD 限制细胞间连通性的分子机制尚不明确。

研究结果

1. Syt1 限制 MAMPs 诱导的 PD 分子通量：通过微粒轰击试验发现，flg22 和几丁质处理可使野生型（WT）植物中荧光蛋白（FP）扩散减少，表明 PD 关闭；而在 syt1-2 突变体中，FP 扩散在处理后无明显变化，且 Syt1-GFP 表达可恢复突变体 PD 表型，说明 Syt1 是 MAMP 诱导 PD 关闭所必需的。通过共表达 Syt1-GFP 和 PD 标记 BFP-PDCB1 进行活细胞成像，发现 Syt1 在 PD 处富集，且 flg22 处理后其在 PD 处的荧光强度增加，蛋白水平也上调。此外，利用羧基荧光素二乙酸酯（CFDA）染色试验进一步验证了 Syt1 对 flg22 诱导 PD 关闭的正向作用。
2. Syt1 与 ANN4 相互作用诱导 PD 胼胝质沉积和关闭：对 syt1-2 突变体进行 PTI 反应评估，发现其 flg22 诱导的 Ca²⁺内流和 ROS 产生显著降低。通过搜索公共 PD 蛋白质组，鉴定出 ANN1 和 ANN4 为潜在的 Syt1 相互作用蛋白，经试验验证，ANN4 是 flg22 诱导 PD 关闭所必需的。Syt1 和 ANN4 在同一通路发挥作用，共同参与 flg22 处理后 PD 处胼胝质沉积，限制细胞间分子通量。亚细胞定位分析表明，ANN4 与 ER 和 PM 相关，且与 Syt1 在 PD 处共定位，二者可相互作用，且该相互作用受 flg22 刺激上调。Syt1 可招募 ANN4 至 PD，而 Syt1 在 PD 的积累不依赖于 ANN4。
3. Syt1/ANN4 复合物调节 flg22 诱导的 PD 相关 Ca²⁺信号：利用新开发的钙传感器 PDLP1-NEMOm 进行超分辨率 Ca²⁺成像，发现 flg22 处理可在 PD 处引发强烈的 Ca²⁺信号振荡，而 syt1 或 ann4 突变体中该信号缺失，表明 flg22 诱导的 [Ca²⁺]_PD爆发由 Syt1/ANN4 复合物介导。使用钙通道阻滞剂 LaCl₃处理，抑制了 flg22 诱导的 [Ca²⁺]_PD爆发和 PD 胼胝质沉积与关闭，说明 [Ca²⁺]_PD增加对限制 flg22 处理后细胞间分子通量至关重要。
4. Syt1/ANN4 复合物与 PD-PM 磷脂的相互作用对调节至关重要：利用荧光磷脂传感器发现，flg22 处理后 PD 处 PI (4,5) P₂水平升高。使用脂质激酶抑制剂渥曼青霉素（Wm）处理，破坏了 PI (4,5) P₂积累，导致 Syt1 和 ANN4 在 PD 的积累受阻，抑制了 [Ca²⁺]_PD爆发和 PD 关闭。通过定点突变 Syt1 的关键脂质结合位点（M316A），发现该突变影响 Syt1 与 PM 脂质的相互作用，使其无法在 PD 富集，且不能恢复 syt1 突变体在 flg22 诱导的 [Ca²⁺]_PD爆发、PD 胼胝质沉积和关闭方面的缺陷，植物对病原体感染的抗性也显著降低。

研究讨论

本研究揭示了 Syt1 在植物先天免疫中调节 PD 通量的机制：flg22 感知后，PD-PM 处 PI (4,5) P₂水平升高，Syt1 感知信号并积累到 PD，招募 ANN4，促进 PD 局部钙信号产生，导致胼胝质沉积和细胞间通讯减少。PD 作为一种特殊的 EPCS，其内部 ER-PM 接触的作用此前尚不明确，本研究表明 Syt1 招募 ANN4 通过调节 PD 局部钙信号调节孔径大小。ANN4 可能作为 Ca²⁺通透转运体或 Ca²⁺通道的辅助因子，但具体机制仍需进一步研究。PD 在免疫信号传导中起重要作用，是特定免疫信号成分的枢纽，多种免疫相关蛋白在 PD 处发挥作用，调节 PD 通透性。PD 膜的脂质环境独特，对其通透性调节至关重要，本研究发现 PI (4,5) P₂在 flg22 诱导的 PD 关闭中起关键作用，但 PIP₂水平重新分布的分子机制有待研究。免疫信号在 PD 处的传导与其他 PM 区域分离，植物细胞内存在钙微区的异质性，未来需进一步研究细胞质和 PD 局部钙变化差异的分子基础。

研究局限

本研究虽发现了 flg22 触发的 PD 相关 Ca²⁺特征以及 Syt1/ANN4 复合物在启动这些 Ca²⁺信号中的作用，但 Ca²⁺信号与 PD 关闭之间的分子联系尚未解决，ANN4 介导 PD 相关 Ca²⁺信号的精确机制仍不清楚。

资源可用性

本研究的所有试剂可从通讯作者 Jiejie Li（[e-mail]）处获取，所有数据在请求时可共享，部分原始数据已存储在 Mendeley（https://doi.org/10.17632/7vjfzfj6xf.2） 。