长读测序揭秘不同大小 AAV 基因组包装能力与模式：基因治疗新视角

该研究利用纳米孔长读测序评估不同大小腺相关病毒（AAV）基因组的包装能力和模式。发现 AAV 基因组超 4.9kb 时，全长基因组比例下降，包装模式改变。还探讨了其对报告基因表达的影响，为 AAV 载体设计和基因治疗提供重要依据。

　　

研究背景

腺相关病毒（AAV）载体在基因治疗中应用广泛，可用于补充缺陷基因功能，治疗罕见遗传病及一些常见难治性疾病。然而，AAV 载体的基因组包装限制在 4.9 - 5.2kb，这制约了治疗性转基因的传递，影响基因治疗效果。了解 AAV 载体的包装能力对其在基因治疗中的有效应用至关重要。

此前评估 AAV 载体货物容量的方法有 Western blotting、电泳、色谱和体外表达等，但这些方法存在局限性，难以全面评估 AAV 基因组情况。传统短读测序无法在需要对基因组不同区域进行定量比较时研究超大 AAV 的影响。而纳米孔长读测序技术操作简单、成本效益高，能在不进行基因组扩增的情况下检测整个 AAV 基因组，为研究提供了新途径。

实验设计

1. 构建不同大小的 AAV 质粒：通过调整包含增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒的 AAV 基因组大小，插入不同长度的 λ 噬菌体间隔序列，构建出 3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb 和 5.5kb 的 AAV 质粒。
2. 动物实验：选用 6 周龄的 C57BL/6J 小鼠，在其双眼视网膜下注射不同大小的纯化 AAV。4 周后，对小鼠眼睛进行组织学评估和 Western blotting 检测，以分析报告基因的表达情况。
3. 测序及分析方法：利用纳米孔长读测序技术对 AAV 基因组进行测序，用 MinKNOW 进行碱基识别，Minimap2 进行序列比对，在 IGV 中可视化比对结果。通过计算起始和终止位置、全长基因组比例、基因覆盖度等指标，评估基因组完整性和包装模式。同时进行琼脂糖凝胶电泳和 TapeStation 分析，辅助判断 AAV 基因组的完整性。

实验结果

1. 质粒评估：构建的 AAV 质粒经 TapeStation 确认，基因组大小与预期相符。纳米孔长读测序显示，质粒编码的载体起始和终止点大多在反向末端重复序列（ITRs）内，不同大小质粒间无明显差异。
2. AAV 载体 DNA 完整性评估：琼脂糖凝胶电泳和 TapeStation 分析表明，AAV 基因组大小为 5.0kb 或更大时存在缺陷。纳米孔长读测序进一步发现，全长基因组比例在 4.9 - 5.0kb 之间急剧下降，5.5kb 时下降更明显。通过对比转染含或不含 AAV 衣壳（cap）基因的 HEK293T 细胞后的结果，推测全长 AAV 基因组在包装过程中丢失，而非基因组合成阶段。
3. AAV 载体功能基因组成分模式分析：纳米孔测序检测四种功能基因组成分（λ 噬菌体间隔序列、巨细胞病毒（CMV）启动子、EGFP 和 polyA）的模式发现，3.5 - 4.8kb 基因组的 AAV 有许多全长基因组；4.9kb 基因组出现小的变化；5.0kb 和 5.5kb 基因组模式差异显著，全长基因组减少，3′端含 EGFP 和 polyA 的短基因组增多，且 5′端覆盖度下降。虽然纳米孔测序误差率相对较高，但不同大小 AAV 的整体模式仍较一致。
4. 报告基因在小鼠视网膜中的表达：组织学分析和 Western blotting 检测发现，尽管 5.0kb 和 5.5kb AAV 载体中全长报告基因表达盒包装很少，但注射后小鼠视网膜中 EGFP 表达水平与 4.7kb 载体相似，仅 5.5kb 载体表达略低。对于携带视网膜色素变性 1（RP1）基因的约 7.0kb AAV 载体，其全长基因组比例极低且不表达 RP1。
5. AAV8.CAG.Venus - GRK1 - 702.mKO1 的体内表达：构建含不同位置报告基因的 5.3kb AAV 载体 AAV8.CAG.Venus - GRK1 - 702.mKO1，纳米孔测序显示其全长基因组包装比例低，但在小鼠视网膜中 Venus 和 mKO1 均有表达。这表明大 AAV 基因组对包装的影响因载体设计而异，且蛋白质表达可能只需少量不完整的功能拷贝和少量启动子序列。

研究讨论

本研究利用纳米孔长读测序有效评估了 AAV 载体基因组完整性。AAV 载体在基因组超 4.9kb 时，全长基因组包装比例大幅下降，主要源于包装缺陷。分析还发现包装模式在 4.9kb 时已改变，这对设计临床基因治疗用 AAV 载体意义重大，为确定有效基因传递的上限提供了参考。

研究揭示了超大 AAV 基因组主要包装短片段，且丢失全长基因组与保留 3′端小片段相关。不同设计的载体包装模式不同，提示需对每个 AAV 载体进行长读测序分析。此外，报告基因表达与基因组包装不完全相关，可能机制包括细胞内基因组重组、重叠序列和反式剪接等，但这些机制能否完全解释观察到的差异仍不确定。

研究也存在局限性。一是仅研究了特定设计的载体，未评估其他 AAV 血清型，结果适用性有待验证；二是未深入探究报告基因在基因组和启动子检测不佳时仍有表达的机制，也未评估 ITR 作为启动子的可能性；三是体内研究仅在小鼠中进行，需在更临床相关的动物模型中进一步探索 AAV 基因组完整性与转基因表达的差异。

总体而言，本研究凸显了长读测序在评估 AAV 载体基因组完整性方面的重要性，对设计超过 4.7kb 的 AAV 载体具有关键指导意义，为基因治疗领域提供了有价值的信息，有助于推动 AAV 载体在基因治疗中的进一步发展和应用。