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为解决难以准确监测洞穴盲鳗（Ophisternon candidum）种群分布的问题，研究人员开发新的代谢条码分析和基于 qPCR 探针的检测方法。结果显示新方法提高了检测灵敏度和成本效益，对该物种监测与保护意义重大。
在神秘的地下水生态系统中，生活着一类特殊的生物 —— 洞穴生物（Stygofauna）。它们大多是短距离特有物种，由于扩散能力有限，对含水层系统的人为改变极为敏感。准确监测这些生物，对于评估环境影响、保护含水层生态至关重要。
在澳大利亚西北部的皮尔巴拉生物区，传统的监测方法是通过采矿勘探钻孔，用改良的浮游生物网采集样本，再进行形态和基因分析。但这种方法依赖专业的形态分类知识，而且捕获率低，难以全面反映洞穴生物群落的多样性。
在这些洞穴生物中，洞穴盲鳗（Ophisternon candidum）尤为特殊。它分布在三个不连续的种群中，在州和联邦层面被列为易危物种，在国际自然保护联盟（IUCN）红色名录中被列为濒危物种。它是皮尔巴拉洞穴生物群落中已知最大的捕食者，对生态系统平衡起着重要作用。然而，由于其生活环境特殊，传统的拖网采样方法很难收集到它，从 2003 年开始的广泛采样中，收集到洞穴盲鳗样本的成功率极低。
近年来，环境 DNA（eDNA）代谢条码分析技术逐渐应用于洞穴生物监测，它能检测出隐藏和稀有物种，还能描述群落组成。但该技术也存在不少问题，比如结果易变、PCR 扩增有偏差、参考序列不足、环境中 DNA 分布不均等，对于像洞穴盲鳗这样难以采样且数量稀少的物种，容易出现检测不足或假阴性结果。而单物种 qPCR 探针检测技术成本效益高，能更高效地检测环境样本中低丰度的遗传物质，但此前还没有针对地下环境中保护物种的相关研究。
基于此，来自澳大利亚科廷大学（Curtin University）、Biologic Environmental Survey 和力拓铁矿石公司（Rio Tinto Iron Ore）的研究人员开展了一项研究，旨在开发一种对洞穴盲鳗特异性更强的代谢条码分析方法，以及基于 qPCR 探针的检测方法，并对这两种新方法进行测试。该研究成果发表在《Conservation Genetics Resources》上。
研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法包括：首先，基于之前项目中使用 16SEelfish 分析检测到的洞穴盲鳗 16S 序列和 GenBank 上的完整线粒体基因组序列，设计能用于代谢条码分析和 qPCR 分析的引物及探针，并进行计算机模拟（in-silico）测试。然后，使用合成寡核苷酸片段对新方法进行优化，确定最佳退火温度、引物和探针浓度等条件。接着，通过梯度稀释系列构建标准曲线，确定基于 qPCR 探针检测方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。最后，用新设计的方法对历史和新采集的环境 DNA 样本进行检测，并在野外进行验证，与之前的 EelFish16S 代谢条码分析方法进行对比 。
研究结果如下：
- 检测方法设计与计算机模拟测试：成功设计出针对洞穴盲鳗的物种特异性检测方法（BCE_16S）。计算机模拟测试显示，虽然其他物种能与引物结合，但除目标物种外，没有其他物种能与探针结合。
- 检测方法优化：代谢条码分析在测试的两种 DNA 浓度下均有扩增，最佳退火温度为 57°C。基于 qPCR 探针的检测方法优化后，确定了最佳反应体系和循环条件。
- 检测限和定量限：标准曲线分析显示精度良好（R2=0.994），计算得出离散 LOD 为 23 拷贝 / 反应，LOQ 为 187 拷贝 / 反应；根据 Klymus 等人的模型计算，LOD 为 7.8 拷贝 / 反应。
- 环境 DNA 样本检测验证：用新开发的代谢条码分析方法，在 9 个阳性样本和 6 个阴性样本中检测到扩增，生物信息分析显示除一个样本外，其他扩增样本中均存在洞穴盲鳗。基于 qPCR 探针的检测方法在 8 个阳性样本和 2 个阴性样本中检测到扩增。
- 野外验证与对比：代谢条码分析方法在 93 个样本中检测到扩增，其中 52 个样本检测到洞穴盲鳗；基于 qPCR 探针的检测方法在 72 个样本中检测到阳性扩增，经 Sanger 测序确认，66 个样本为目标物种。两种方法共在 76 个样本中检测到洞穴盲鳗，部分检测结果仅在一种方法中出现。
研究结论和讨论部分指出，新开发的 BCE_16S 代谢条码分析和基于 qPCR 探针的检测方法，相比之前的 EelFish16S 代谢条码分析方法，提高了检测灵敏度，降低了成本。尽管历史样本检测结果受 DNA 降解影响，但野外验证表明新方法表现良好。基于 qPCR 探针的检测方法灵敏度比之前的方法有显著提升，且特异性更强，减少了假阳性样本的测序成本。不过，为避免假阳性结果，建议对阳性 qPCR 扩增结果进行 Sanger 测序验证。这项研究为洞穴盲鳗的持续监测提供了有效工具，也为地下环境中稀有或隐秘物种的检测提供了新的思路和方法，对保护这些物种和维护地下水生态系统平衡具有重要意义 。
