Nature子刊：破解单细胞蛋白质组学中的蛋白质泄露难题

在单细胞蛋白质组学实验中，样本制备时的蛋白质泄露影响数据质量。研究人员以小鼠气管单细胞为对象，开展蛋白质泄露影响的研究。结果表明可识别受影响细胞并排除分析，相关分类工具可检测和纠正该问题，有助于提升数据质量。

　　

单细胞蛋白质组学（Single-cell proteomics）有助于解析蛋白质丰度、修饰、合成和降解对单细胞功能的影响。为了实现这一潜力，就必须尽量减少样本制备过程中细胞和蛋白质的变化。然而，样本的冷冻保存可能会造成细胞损伤，并导致单细胞蛋白质组学数据出现偏差。

以往的研究发现，在单细胞RNA测序中，受损细胞膜会导致转录本泄漏，而蛋白质不仅在亚细胞定位、物理性质和结合相互作用等方面存在显著差异，而且其大小约为mRNA模板的十分之一，在细胞膜受损时更易泄漏。这些问题可能会影响单细胞蛋白质组学的数据质量。

为此，美国东北大学和麻省总医院的研究人员通过分析数千个小鼠细胞来鉴定蛋白质泄露的影响。这项研究成果于5月2日发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员选择了小鼠气管上皮的原代组织，将解离后的细胞分为两组，一组新鲜制备后进行单细胞蛋白质组学分析，另一组在10% DMSO和90% 胎牛血清中冷冻保存后再进行分析 。

他们利用TMTpro 35重标记技术，共制备了2784个单细胞样本，并通过单细胞蛋白质组学（pSCoPE）技术开展分析。同时，使用Sytox green染色来识别细胞膜通透性受损的细胞，并将染色强度与单细胞数据相关联。

研究人员发现，新鲜细胞中Sytox green阴性细胞占96%，而冷冻细胞中仅占72%，其中细支气管外分泌细胞（club cells）的通透性增加尤为明显，这可能反映了其较为脆弱的状态。

通过LIGER算法对细胞类型进行分配时，他们发现与新鲜样本相比，冷冻样本与单细胞mRNA数据集的对应性较低，但仍能基于标记蛋白的丰度确定细胞类型。此外，通透细胞的比例在不同细胞类型中分布不均。

之后，研究人员探究了哪些蛋白质在通透细胞和完整细胞之间出现显著变化。他们发现，大多数改变的蛋白质在通透细胞组分中减少，表明蛋白质从这些细胞中泄漏。

不同亚细胞区室的蛋白质变化存在差异，线粒体蛋白在通透细胞和完整细胞中的丰度没有显著差异，而细胞质中的蛋白丰度下降最为明显。例如，过氧化物酶等代谢酶以及参与糖酵解的酶丰度大约降低了两倍。

之后，研究人员尝试用分类工具来识别细胞膜受损的细胞。他们利用75种明显泄露蛋白质的丰度来训练XGboost模型。在相同细胞类型上训练和测试时，这个模型的分类成功率很高（AUC = 0.92）。在不同细胞类型测试时，虽然性能略有下降，但仍能识别出大部分通透细胞（AUC = 0.86） 。

他们将这个模型整合到QuantQC R包中，以便用于不同样本和工作流程。他们还对之前发表的人类细胞系数据集进行验证，表明蛋白质泄露现象具有普遍性。

这项研究表明，蛋白质泄露对单细胞蛋白质组学的结果有重大影响，通过在分析中排除通透细胞，能够直接解决这一问题。研究人员提供的蛋白质泄露特征和分类工具，可用于检测和纠正这一假象。

研究成果强调了在单细胞蛋白质组学分析中纳入蛋白质泄露解决方案的重要性，并提供了有效的解决方案。这有助于减少批次效应，促进对冷冻组织样本的分析，让实验人员在未来研究中具有更大的灵活性。