间歇性泊沙康唑疗法对慢性恰加斯病防治无效，无菌治愈仍是关键

恰加斯病由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）感染引起，可导致心脏和胃肠道损伤。本文研究发现，间歇性泊沙康唑治疗虽能降低寄生虫负荷，但无法长期预防或缓解慢性恰加斯病的心脏和消化道病变，无菌治愈才是药物研发的关键目标。

　　

引言

恰加斯病是由克氏锥虫感染引发的疾病，在拉丁美洲是重要的公共卫生问题，并且随着人口迁移，在非流行地区也越来越多地被检测到。克氏锥虫主要通过锥蝽传播，也可经先天性传播、食用被污染的食物和饮料、器官移植及输血等途径感染。

感染克氏锥虫后，患者会经历急性期，一般持续 2 - 8 周，此时寄生虫在血液和组织中广泛传播，症状通常较轻或不具特异性，但少数情况下可能因心肌炎或脑病而致命。之后，免疫系统会控制感染，但无法完全清除寄生虫，多数人进入无症状期。然而，约 30% 的感染者最终会发展为慢性恰加斯病，其中 20 - 30% 会出现慢性恰加斯心肌病（CCC），约 10% 会发展为消化道恰加斯病（DCD），部分患者两种症状会同时出现 。

目前对于 CCC 的发病机制有多种假说，较为认可的是寄生虫引发的促炎免疫反应导致心脏组织累积性损伤，进而引发纤维化、心肌肥厚和心肌病，疾病进展复杂，难以预测。在慢性感染阶段，寄生虫负荷极低，部分患者难以检测到。在小鼠模型中，胃肠道、皮肤和部分品系的骨骼肌是寄生虫的储存库。心脏感染在慢性期呈周期性而非持续性，间歇性感染引发的促炎反应虽能清除感染，但常损害周围组织。由于心肌和神经组织再生能力低，使得病变呈进行性发展 。

DCD 会导致肠道运动、分泌和吸收功能改变，尤其是结肠和食管。目前认为不可逆的肠神经系统去神经支配会导致肠道运动功能障碍，出现吞咽困难、胃肠传输缓慢和粪便潴留，最终发展为巨结肠或巨食管 。近期开发的小鼠 DCD 模型为研究其发病机制提供了平台。

几十年来，克氏锥虫感染主要使用硝基杂环类药物苯硝唑和硝呋莫司治疗，但存在治疗失败率高（10 - 50%）的问题，原因包括治疗周期长（60 - 90 天）、药物毒性导致患者依从性差以及对不同克氏锥虫物种的疗效差异大。此外，这两种前体药物在寄生虫体内由同一种线粒体硝基还原酶（TcNTR - 1）激活，可能产生交叉耐药性。因此，国际上有多个药物研发联盟致力于开发新的治疗药物。泊沙康唑作为一种抗真菌药物，可抑制克氏锥虫的甾醇 14α - 去甲基酶（CYP51），在体外具有纳摩尔级的抗寄生虫活性，体内疗效也有前景，且安全性良好，已获人类使用许可，但最终临床试验失败，在小鼠体内也无法实现常规的无菌治愈 。

动物实验表明，苯硝唑的治愈性治疗能有效阻止心脏病变的发展，尤其是在感染早期给药。在小鼠 DCD 模型中，急性期的治愈性治疗可阻止疾病进展，改善肠道运动功能，恢复结肠肌间神经元密度。而非治愈性治疗虽能使胃肠道症状暂时改善，但感染复发会导致病变再次出现。这些实验表明，寄生虫的存在是引发免疫介导的组织损伤，进而导致恰加斯病病变的关键因素。

新的恰加斯病药物的目标产品特征要求在感染的无症状慢性期实现寄生虫学治愈，这符合当前对疾病发病机制的认识，即及时干预可阻止病变进一步发展。但开发符合这一特征的新药难度较大。鉴于恰加斯病的进行性特点，一种替代治疗策略是长期间歇性给药，降低寄生虫负荷，减缓组织损伤的积累，使患者在有生之年不出现症状性病变和器官功能障碍。本研究使用感染克氏锥虫的小鼠，长期用泊沙康唑治疗，在寄生虫负荷大幅降低但未被清除的情况下，验证这一假说。

结果

1. 实验模型与药物处理：选用雌性 C3H/HeN 小鼠，感染表达红色荧光素酶基因的克氏锥虫 JR - Luc 株。感染后 21 天开始，小鼠每天接受一次泊沙康唑（20mg/kg）治疗，持续 12 天。之后，一组小鼠不再接受治疗（初始治疗组）；一组小鼠每月接受 5 天的泊沙康唑治疗（20mg/kg），直至实验终点（31 周感染后，wpi）；一组小鼠每周接受一次 20mg/kg 的泊沙康唑治疗（每周治疗组） 。
2. 寄生虫负荷变化：初始 12 天治疗后，生物发光水平降低超过 99%，接近背景水平。但停药后，初始治疗组小鼠感染全部复发，2 - 3 周内寄生虫负荷恢复到与未治疗对照组相似的水平。之后随着感染进入慢性期（>11wpi），寄生虫负荷有所下降 。每月治疗组每次治疗后寄生虫负荷降至背景水平，但随后又会反弹，后期反弹峰值高于未治疗对照组 。每周治疗组在 22wpi 前寄生虫几乎检测不到，但之后复发程度也有所增加，但并不一致 。实验终点时，所有治疗组小鼠仍被感染，初始治疗组和每月治疗组的总体感染水平与未治疗小鼠相似，每周治疗组可检测到的感染灶较少 。
3. 寄生虫耐药性检测：从感染小鼠的多种组织中分离出 12 个寄生虫克隆，在感染的 COLO - N680 细胞培养物中进行检测，结果显示这些克隆对泊沙康唑均未表现出耐受性增加 。
4. 消化道功能评估：通过口服红色染料示踪剂胭脂红评估小鼠的胃肠道（GI） transit 时间，以此作为 DCD 的标志物。未治疗小鼠在急性期出现 GI transit 延迟，在 4.5wpi 达到峰值，之后有所缓解，但在慢性期（24wpi 及以后）症状加重 。非治愈性的泊沙康唑治疗（初始治疗组）可使 GI transit 延迟迅速逆转至未感染对照组水平，但效果是暂时的，12 周时恢复到未治疗小鼠水平，到实验终点（30wpi）时症状进一步加重 。每月和每周治疗组虽能维持 GI transit 延迟的逆转至 18 周以后，但 24 周时也达到与未治疗小鼠相似的水平。30wpi 时，所有感染组的部分小鼠 GI transit 时间延迟超过 4 小时，表明出现了严重的慢性 DCD 病变 。

在实验终点，研究人员还评估了治疗方案对便秘表型的影响，通过检测禁食 2 小时后结肠内的粪便颗粒数量发现，所有治疗组的粪便颗粒数量均比未感染小鼠多两倍以上，且与未治疗小鼠无统计学差异。这表明，在本实验条件下，长期的抑制性泊沙康唑治疗并不能改善慢性 DCD 的症状。
5. 心脏病理评估：通过定量分析胶原蛋白含量来评估心肌纤维化程度，以此判断心脏病理变化。未感染的年龄匹配对照组小鼠的胶原蛋白含量较为一致，且比未治疗的感染小鼠低三到四倍（P = 0.01）。感染小鼠的纤维化水平差异较大，反映了人类感染的情况。未治疗小鼠与初始治疗组小鼠的胶原蛋白含量无显著差异。每周或每月接受泊沙康唑治疗的感染小鼠，其胶原蛋白沉积程度与未治疗组也无显著差异，说明间歇性治疗方案没有明显益处 。

讨论

抗克氏锥虫感染的药物研发策略通常基于实现无菌治愈的需求。一种替代策略是长期使用药物，虽不能消除感染，但能将寄生虫负荷维持在引发症状性病变所需阈值以下。泊沙康唑是一种耐受性良好的抗真菌药物，能将克氏锥虫感染降低到极低水平，但通常无法完全清除寄生虫 。本研究中，初始治疗使寄生虫负荷低于体内成像检测水平，但随后全部复发 。每月治疗虽能使寄生虫负荷暂时降至背景水平，但停药后会反弹，有时甚至高于未治疗对照组 。不过，治疗持续降低寄生虫负荷的能力表明，长期间歇性给药并未导致泊沙康唑耐药，实验终点时对寄生虫的敏感性检测也证实了这一点 。泊沙康唑是一种抑制锥虫生长的药物，在体外对细胞内寄生虫的抑制作用会达到平台期，增加药物浓度也无法进一步抑制生长 。多次抑制性治疗后寄生虫复发程度增加，可能是由于选择性瓶颈，使体内生长速率稍高的寄生虫在种群中占主导地位 。

在 C3H/HeN:TcJR - Luc 宿主 - 寄生虫模型中，DCD 表现为感染急性期出现的 GI transit 延迟，随后会部分恢复，但随着小鼠进入慢性期，症状会进一步恶化。用苯硝唑进行治愈性治疗，可使急性期的 GI 功能恢复，同时伴随着肌间神经丛神经元密度的恢复 。本研究中，未治疗感染小鼠的 GI transit 时间也呈现双相曲线 。急性期开始的非治愈性泊沙康唑抑制治疗可使功能障碍迅速逆转，但 12 周时又恢复到未治疗感染小鼠的水平，之后进一步恶化 。每月和每周间歇性治疗组虽能延缓慢性期症状的出现，但 24 周时肠道运动功能仍下降到未治疗小鼠的水平。实验终点时，这些组的 GI transit 与未感染组相比明显受损 。而苯硝唑治愈的小鼠在慢性期 GI transit 时间不会恶化，说明及时实现无菌治愈可持久恢复 GI 功能 。

未治疗小鼠急性期后期 GI transit 时间部分改善，慢性期又进一步下降，这表明可能有两种不同机制驱动 GI transit 病变，这与 CCC 类似，CCC 急性期与心肌炎有关，慢性期则与累积性损伤和纤维化组织修复导致的心肌病有关 。慢性期时，所有感染组的部分小鼠 GI transit 时间延迟超过 4 小时，表明 DCD 病变比早期更严重 。克氏锥虫感染胃肠道会导致肠神经系统神经元逐渐丢失，使肠道运动功能逐渐下降，尤其是结肠 。对结肠粪便潴留的终点评估也发现，非治愈性治疗的小鼠与未治疗对照组相比，没有明显改善，所有治疗组的粪便潴留均显著增加 。因此，在本实验条件下，长期抑制性泊沙康唑治疗无法改善慢性 DCD 症状。

在慢性感染克氏锥虫 JR - Luc 株的 C3H/HeN 小鼠中，器官 / 组织的寄生虫分布比其他小鼠模型更广泛，高达 80% 的小鼠经体外成像检测显示有心脏局部感染 。无论分析时心脏是否感染，小鼠都会出现广泛的心脏纤维化，这是 CCC 的标志 。与 DCD 数据一致，本研究结果表明，长期非治愈性间歇性泊沙康唑治疗在实验终点也无法显著预防心脏纤维化。尽管总体寄生虫负荷得到抑制，尤其是每周治疗方案，但胃肠道和心脏病变的严重程度并未显著降低。一种可能的解释是，寄生虫复发的短暂性和波动性可能影响炎症免疫反应的动态平衡，抵消了降低总体寄生虫负荷带来的益处。

综上所述，本研究考察了两种间歇性泊沙康唑治疗方案对慢性恰加斯病三个关键病变（GI transit 延迟、粪便潴留和心脏纤维化）的影响。研究表明，即使寄生虫负荷显著降低，这些抑制性方案也无法预防或缓解慢性 DCD 或 CCC 的长期发展。虽然其他治疗方案或药物可能进一步降低寄生虫负荷，但总体而言，这些结果强调了无菌治愈应仍是任何进入临床的抗寄生虫恰加斯病药物的必备条件。

材料和方法

1. 小鼠饲养、感染和治疗：实验使用表达红色荧光素酶基因的克氏锥虫 JR 株（离散分型单元 I，DTU I），即 TcJR - Luc 。寄生虫的培养和组织培养型锥鞭毛体（TCTs）的制备方法如先前所述 。购买 CB17 - SCID 小鼠，腹腔注射 5×10⁴个 TCTs，通过心脏穿刺获取血液型锥鞭毛体（BTs） 。7 - 10 周龄的雌性 C3H/HeN 小鼠腹腔注射 1×10³个来自 SCID 小鼠的 BTs 进行感染 。各研究组小鼠饲养在无病原体的通风笼中，保持 12 小时光照 / 黑暗循环，自由进食和饮水。泊沙康唑（Biosynth, Ltd.；20mg/kg）通过柔性插管经口灌胃给药，溶剂为 5% 二甲基亚砜（v/v）和 95%（0.5% 羟丙甲纤维素和 0.4% 吐温 80 的 Milli - Q 水）。未治疗小鼠在初始 12 天治疗期仅给予溶剂灌胃 。实验 31 周终点时，所有小鼠在深度麻醉（dolethal，60mg/kg 腹腔注射）下采血处死，进行解剖，取出器官并进行生物发光成像，收集特定器官用于进一步分析 。
2. 体内和体外生物发光成像：所有小鼠腹腔注射 150mg/kg D - 荧光素，5 分钟后用 2.5%（v/v）的气态异氟醚在氧气中麻醉 。再过 5 分钟后，使用 IVIS Spectrum 系统（Revvity, Hopkinton, MA, USA）进行成像，通过单独的鼻锥维持麻醉。使用 Living Image v4.7.3 软件采集腹侧和背侧图像，根据信号强度设置 30 秒至 5 分钟的曝光时间。以未感染小鼠为参照，设置体内成像阈值为 5 分钟曝光、大像素合并 。成像后小鼠复苏并放回笼中。

为估算感染过程中的寄生虫负荷，使用 Living Image v4.7.3 软件在生物发光成像的小鼠体内图像上绘制感兴趣区域（ROIs），以总通量（光子 / 秒）表示 。通过研究中各成像日未感染小鼠的 ROI 数据获得体内成像的估计检测阈值 。

在解剖前，小鼠禁食 2 小时用于粪便颗粒分析。进行体外成像时，腹腔注射 150mg/kg D - 荧光素，5 分钟后在深度麻醉下采血处死小鼠。用 10mL 0.3mg/mL 的 D - 荧光素 PBS 溶液灌注小鼠，取出器官并按标准方式放置在培养皿中，连同剩余的 carcass 一起浸泡在 0.3mg/mL 的 D - 荧光素 PBS 溶液中 。对放置在培养皿中的器官和 carcass 进行成像，曝光时间为 5 分钟，采用大像素合并 。
3. 从小鼠组织中回收寄生虫：取出的器官在冰冷的不含钙 / 镁的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）中保存，直至进行分离。用无菌手术刀将组织切成 3 - 4mm 的小块，用 PBS 洗涤 3 次以去除血液和碎片，转移到含有新鲜配制的胶原酶溶液（100U/mL 胶原酶 IV 的 HBSS 溶液）的试管中，在 37°C 孵育 2 小时 。然后将细胞悬液通过 200μm 细胞滤网过滤，离心（300g，7 分钟） 。将沉淀重悬于 HBSS 中，使用 2mL 裂解基质 M（MP）在 Precellys 24（Bertin）仪器中进行裂解，设置两个循环，每个循环 1 分钟，速度为 5000 。再次离心（50g，5 分钟）去除碎片，上清液再离心（3000g，5 分钟）沉淀寄生虫。最后将寄生虫重悬于无鞭毛体培养基中，在 48 孔板中于 28°C 的 CO₂培养箱中培养 。
4. 体外泊沙康唑敏感性测定：为促进无鞭毛体向循环后期锥鞭毛体转化，将 TcJR - Luc 无鞭毛体以 5×10⁵/mL 的密度传代培养 14 天，直至稳定期（约 15% 的寄生虫发生转化） 。取 1 - 2mL 培养表面的液体转移到 Eppendorf 管中，通过离心（3000g，5 分钟）收集游动的循环后期锥鞭毛体。将沉淀重悬于含有 5% 热灭活胎牛血清（FBS）、100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素的最低必需培养基（MEM）中，加入到 60 - 70% 汇合的 COLO - N680 细胞（人食管鳞状细胞癌细胞系）培养物中 。在 37°C 的 CO₂培养箱中培养，每 2 - 3 天更换一次培养基。感染后第 8 天，收集细胞上清液中的 TCTs，离心后重悬于高糖（4g/L）的杜氏改良 Eagle 培养基中并计数 。

利用 TcJR - Luc 内在的荧光素酶表达来监测细胞内寄生虫的复制。将 COLO - N680 细胞以 5×10⁴个细胞 / 孔的密度接种在白色、透明底部的 96 孔微孔板中，每孔加入 100μL 生长培养基 。8 小时后，每孔用 5×10⁵个 TCTs 感染过夜 。次日，用 PBS 洗涤细胞 3 次，去除未内化的 TCTs，然后加入 200μL 含有不同浓度泊沙康唑的 MEM 培养基（添加 2.5% FBS） 。通过 2:1 系列稀释生成 8 点效价曲线以评估活性 。实验终点（96 小时）时，用 PBS 洗涤细胞 1 次，在 100μL 新鲜培养基中孵育 30 分钟 。随后加入 100μL 重组 Bright - Glo 荧光素酶检测系统试剂（Promega），在黑暗中室温孵育 2 分钟使细胞裂解 。使用 BMG FLUOstar Omega 仪器对生物发光进行三次重复定量，每孔测量时间为 3 秒 。计算每个克隆相对于未处理对照的生长抑制百分比后拟合剂量 -