基孔肯雅病毒nsP1的马鞍形曲率关联促进细胞内复制复合体组装的机制研究

为解决正链RNA病毒如何在宿主细胞膜曲率调控下形成复制复合体这一关键问题，研究人员通过纳米结构阵列和分子动力学模拟，揭示了基孔肯雅病毒(CHIKV)非结构蛋白nsP1通过疏水膜关联(MA)环感知正曲率并形成十二聚体环稳定负曲率的双机制。该研究首次阐明病毒利用几何特性指导复制器官形成的分子基础，为抗病毒靶点设计提供了新思路。

　　

在病毒与宿主细胞的博弈中，正链RNA病毒如基孔肯雅病毒(CHIKV)、登革病毒(DENV)甚至SARS-CoV-2，都会在宿主细胞内构建特殊的膜结构作为"复制工厂"。这些由弯曲膜形成的纳米级隔室，既能保护病毒RNA，又能高效促进基因组复制。然而，病毒如何精确操控宿主细胞膜的几何形态形成这些结构，一直是未解之谜。尤其令人困惑的是，冷冻电镜研究发现CHIKV的复制器官颈部存在独特的马鞍形曲率——同时包含正曲率和负曲率的复杂三维结构，但传统技术难以解析这种纳米尺度下蛋白-膜互作的动态过程。

针对这一挑战，来自南洋理工大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表创新性研究。他们巧妙设计纳米结构阵列，结合超分辨成像和计算模拟，首次揭示CHIKV非结构蛋白nsP1通过"双曲率调控"机制驱动病毒复制复合体组装的分子奥秘。

研究采用多学科交叉技术：1）电子束光刻制备具有梯度曲率的纳米棒/纳米环阵列，模拟细胞膜不同曲率状态；2）激光共聚焦和STED超分辨显微镜活细胞成像，追踪nsP1在预设曲率膜上的分布；3）分子动力学模拟分析nsP1单体及十二聚体与膜的相互作用能；4）扩展显微镜(ExM)纳米级解析病毒感染细胞的复制位点空间组织。

正曲率促进CHIKV nsP1在活细胞中的膜关联
通过U2OS细胞表达eGFP标记的nsP1发现，该蛋白在纳米棒末端（曲率半径≤150 nm）富集程度显著高于平坦区域（end-to-center ratio=2.129±1.718），而阴性对照GFP无此特性。STED超分辨成像显示多个nsP1 puncta特异性聚集在正曲率位点，且荧光漂白恢复(FRAP)实验证实其结合稳定性显著高于平坦膜区域。

体外重建nsP1的曲率依赖性膜结合
在含30% POPS的支撑脂质双层(SLB)上，细菌表达的nsP1单体(eGFP-nsP1-(b))在100-600 nm梯度纳米棒中，对小曲率半径（≤300 nm）表现出剂量依赖性结合偏好。膜电荷分析显示，虽然带负电的磷脂酰丝氨酸(PS)增强nsP1膜结合，但曲率敏感性主要取决于脂质几何特性而非电荷。

膜关联(MA)环驱动曲率感知的分子机制
AlphaFold预测结构显示nsP1具有两个含疏水残基的MA环（a.a.220-233和407-427）。哺乳动物表达的MA环突变体(eGFP-nsP1-MA loop mut-(m))丧失曲率响应能力，且在CHIKV反式复制系统中使基因组/亚基因组RNA表达降低约80%。分子动力学模拟揭示：nsP1十二聚体通过MA环2插入弯曲膜，其结合能（-675 kJ/mol）显著高于平坦膜，且插入深度增加11%（P<0.0001）。

纳米环阵列引导病毒基因组复制
创新设计的纳米环结构证明，CHIKV复制不仅需要内环边缘的正曲率膜（dsRNA富集程度与内环周长正相关），还需中央空间容纳膜球茎(spherule)生长。ExM显示nsP1定位于dsRNA puncta边缘，证实其通过稳定复制器官颈部马鞍形曲率（x-z平面正曲率感知+x-y平面负曲率固定）促进RNA合成。

该研究突破性地提出"双平面曲率解耦"机制：nsP1单体通过柔性MA环动态感知复制过程中不断变化的x-z平面正曲率，而刚性十二聚体环则维持x-y平面固定负曲率。这种独特的马鞍形曲率调控策略，为理解多种正链RNA病毒的膜重塑机制提供了范式。所开发的纳米结构平台不仅为病毒学研究提供新工具，其揭示的几何调控原理对发展靶向膜曲率的抗病毒策略具有重要指导意义。