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为探究 E3 连接酶 Ufd4 介导 K29/K48连接泛素化的机制，研究人员开展相关研究。结果发现 Ufd4 优先催化 K48连接泛素链上的 K29连接泛素化，形成分支链。该研究为理解泛素化机制提供重要依据。
在细胞的生命活动中，蛋白质的命运常常受到精细的调控，而泛素化修饰就是其中极为关键的一环。多聚泛素化（Poly-ubiquitination）由一个泛素（Ub）的 C 末端甘氨酸连接到另一个泛素表面的氨基（如 M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63 等位点）形成，它几乎掌控着真核生物所有的细胞进程。不同连接方式的泛素链有着独特的功能，像是研究较为透彻的 K
48连接的泛素链，作为降解信号，能将底物蛋白靶向蛋白酶体进行降解。然而，近年来越来越多的证据表明，K
48连接的泛素链还能在其他赖氨酸（Lys，简称 K）位点同时发生泛素化，进而形成分支泛素链。这些分支泛素链能够改变原有 K
48连接泛素链的构象，编辑其功能信号，在细胞周期调控、信号通路激活等过程中发挥重要作用 。
在众多分支泛素链中，K29/K48异源泛素链最早在 N - 末端降解途径中被发现，它可以加速 N 端底物的降解。这种异源泛素链由 Ubr1 和 Ufd4 两种不同的 E3 连接酶催化形成，其中 Ufd4 负责以 K29连接特异性的方式增强 K48连接的泛素链。尽管 Ufd4 在这一过程中至关重要，但它究竟如何在 K48连接的泛素链上引入 K29连接的泛素链，从而增加多聚泛素化的进程，其具体机制一直是个未解之谜。此外，HECT 型 E3 连接酶在催化形成特定分支泛素链方面的机制也有待探索。为了揭开这些谜团，来自上海交通大学和清华大学等机构的研究人员展开了深入研究。
研究人员运用了多种技术方法来探索 Ufd4 介导的泛素化机制。其中，冷冻电镜（cryo-EM）技术是关键手段之一，通过该技术可以解析蛋白质复合物的结构，直观地观察 Ufd4 在泛素化过程中的分子构象变化。同时，研究人员还采用了生化测定、质谱分析等方法，对 Ufd4 催化的泛素化反应进行定性和定量分析，确定泛素链的拓扑结构和修饰位点。在实验中，研究人员构建了多种质粒用于表达和纯化相关蛋白，制备了不同类型的泛素链和荧光标记底物，为各项实验的开展提供了物质基础。
Ufd4 偏好于在 K48连接的泛素链上合成分支泛素链
研究人员首先对 Ufd4 介导的多聚泛素化反应进行了重构，使用酵母泛素激活酶（E1）Uba1、泛素结合酶（E2）Ubc4、HECT 型 E3 连接酶 Ufd4 和野生型（WT）泛素，以单泛素（MonoUb）、K29连接的二聚泛素（K29-linked diUb）或 K48连接的二聚泛素（K48-linked diUb）为底物进行反应。结果发现，相较于 MonoUb 或 K29-linked diUb，Ufd4 在 K48-linked diUb 底物上表现出更强的多聚泛素化活性。进一步对 8 种不同链型的二聚泛素底物进行活性测定，以及对不同长度的 K48连接泛素链进行 Ufd4 泛素化测定，均证实了 Ufd4 对 K48连接泛素链的偏好性。
为了确定 Ufd4 在 K48连接泛素链底物上生成的泛素链拓扑结构，研究人员进行了一系列生化和质谱分析。结果显示，Ufd4 特异性地在单泛素化底物上介导 K29连接的泛素化，并且当使用 Ub-K29R 突变体时，Ufd4 在 K48连接泛素链底物上的多聚泛素化活性显著降低。通过 Middle-down MS 分析（Ub-clipping）发现，多聚泛素化产物中存在分支泛素链，且 Ufd4 对 K48连接二聚泛素近端 K29位点的泛素化效率更高。综合这些结果表明，Ufd4 优先催化在预组装的 K48连接泛素链上形成 K29/K48分支泛素链。
Ufd4 催化 K29/K48分支泛素化的结构可视化
为了深入探究 Ufd4 如何将其硫酯键结合的泛素转移到 K48连接二聚泛素底物近端 K29位点的分子机制，研究人员通过化学方法构建了一个稳定的复合物来模拟相应的过渡态。他们首先合成了一种工程化的 K29/K48分支三聚泛素探针（triUbprobe），然后将其与 Ufd4 在催化残基（C1450）依赖的方式下进行交联，形成目标稳定复合物。对该复合物进行单颗粒冷冻电镜分析，获得了整体分辨率为 3.31 ? 的冷冻电镜图。
Ufd4 与结合在 K48连接二聚泛素近端 K29位点的供体泛素形成的复合物（Ufd4-triUbK29/K48 complex）整体呈闭环形状，Ufd4 像一个夹子一样夹住供体泛素和 K48连接二聚泛素。Ufd4 与 K48连接二聚泛素的结合通过多个界面进行，其中 ARM 区域的两个螺旋重复序列（UIHC1 和 UIHC2）和 HECT 结构域的 C 叶与 K48连接二聚泛素相互作用，这种相互作用使得近端泛素的 Lys29 侧链朝向 Ufd4 的活性半胱氨酸，为 K29连接的分支泛素化奠定基础。通过对 Ufd4 与供体泛素相互作用的分析发现，HECT 结构域 C 叶的特定区域与供体泛素相互作用，将供体泛素的 C 末端硫酯定位在靠近近端泛素 K29侧链的位置，促进了 K29连接的分支泛素化。
体内验证 Ufd4 与 K29/K48分支三聚泛素之间关键相互作用
研究人员利用 43-mer 1 型降解肽和截短底物 Scc1（268 - 384 位氨基酸）进行 Ufd4 介导的多聚泛素化实验，以探究结构中观察到的关键界面的作用。结果显示，野生型 Ufd4 能够进一步延长这些底物上的多聚泛素链，而 Ufd4 突变体 FTI、R1468A 和 H317A 的泛素链延长活性则显著降低。
为了在生理环境中验证这一结构机制，研究人员进行了酵母生长实验。在酿酒酵母中，Mgt1 的泛素化水平受 Ufd4 和 Ubr1 调控，其降解会导致酵母在暴露于 DNA 烷化剂 MNNG 时死亡。研究人员构建了 Ufd4 敲除的酵母菌株，并用 Ufd4 或其突变体进行互补。结果表明，野生型 Ufd4 互补的菌株在 MNNG 处理后生长受到抑制，而突变体互补的菌株则生长减缓，且 Mgt1 的降解效率也受到影响。这些结果有力地支持了 Ufd4 与 K29/K48分支三聚泛素关键界面与其功能效应之间的相关性，突出了这些相互作用在调节 Mgt1 降解中的关键作用。
TRIP12 形成 K29/K48分支泛素链的保守机制
TRIP12 是 Ufd4 的人类同源物，已被发现可促进 PROTAC 诱导的新底物降解，通过与 K48连接泛素链特异性的 CRL2 复合物合作形成 K29/K48分支泛素链。研究人员以 K48连接二聚泛素为底物，重构了 TRIP12 催化的泛素化反应，发现 TRIP12 与 Ufd4 相似，在 8 种不同的二聚泛素连接类型中，对 K48连接二聚泛素底物表现出最强的泛素化活性，且能生成 K29/K48分支泛素链。
研究人员使用 triUbprobe获得了 TRIP12 催化复合物的模拟物，并解析了其冷冻电镜结构。结果显示，TRIP12 与底物 K48连接二聚泛素的结合方式与 Ufd4 相似，ARM 区域和 HECT 结构域 C 叶协同夹住 K48连接二聚泛素。通过对 TRIP12 与底物相互作用关键残基的突变分析发现，这些突变显著降低了泛素化活性，表明 Ufd4 和 TRIP12 在形成 K29/K48分支泛素链方面具有保守的酶学性质和结构机制。
Ufd4 与 E2 酶 Ubc4 复合物的冷冻电镜结构
为了深入了解 Ufd4 的催化级联反应，研究人员通过化学连接的方法构建了 Ufd4 从 Ubc4 接受泛素硫酯的复合物，并进行冷冻电镜分析。获得了三个不同分辨率的冷冻电镜重构结果，其中最高分辨率为 3.52 ? 的结构显示，Ubc4 被 Ufd4 的 HECT 结构域 N 叶和 C 叶包围，其催化半胱氨酸与 Ufd4 的催化半胱氨酸位置接近，暗示该结构可能代表一种活性转硫酯状态。
Ufd4 的 HECT 结构域 N 叶和 C 叶与 Ubc4 存在多个相互作用界面，如 Ubc4 的 F63 残基与 Ufd4 HECT 结构域 N 叶的疏水凹槽结合，对 E2/E3 相互作用的特异性起关键作用。当 Ubc4 的 F63 突变为丙氨酸时，转硫酯活性几乎完全丧失。此外，Ufd4 HECT 结构域 N 叶和 C 叶的其他一些残基与 Ubc4 的相互作用也对 E3~Ub 硫酯的形成至关重要，突变这些残基会影响泛素从 Ubc4 转移到 Ufd4 的过程。
Ufd4 从转硫酯到 K29连接泛素组装的转变模型
研究人员通过比较 Ufd4 与 Ubc4 复合物（代表 HECT E3 酶 E2 到 E3 转硫酯状态）和 Ufd4-triUbK29/K48复合物（代表 E3 到底物泛素化状态）的结构，分析了 HECT E3 酶在不同状态下的结构域构象变化。发现 Ufd4 的 ARM 区域和 HECT 结构域 C 叶在两种状态下发生了明显的构象变化，而 HECT 结构域 N 叶的结构在状态转变过程中保持相对稳定。
基于这些结构分析，研究人员提出了 Ufd4 催化过程的功能模型：首先，Ubc4~Ub 被 Ufd4 的 HECT 结构域招募；然后，泛素从 Ubc4 转移到 Ufd4 并释放 Ubc4；接着，ARM 区域和 C 叶的构象重新调整，共同夹住 K48连接二聚泛素底物，使底物近端的 Lys29 朝向 Ufd4 的催化半胱氨酸 C1450；最后，泛素硫酯从 Ufd4 的催化半胱氨酸转移到底物近端的 Lys29 上，完成 K29/K48分支泛素链的形成。
在本研究中，研究人员通过生化和结构生物学研究，揭示了 HECT 型 E3 连接酶 Ufd4 催化形成 K29/K48分支多聚泛素化的分子机制。首次实现了对 Ufd4 接受和转移泛素形成 K29/K48分支多聚泛素化过程的结构可视化，明确了 Ufd4 特异性识别底物泛素链并组装分支泛素链的关键结构元件和分子机制。同时发现 Ufd4 的人类同源物 TRIP12 在形成 K29/K48分支泛素链方面具有保守的机制，这为理解蛋白质降解过程中泛素化的精细调控提供了重要依据，也为相关疾病的治疗和药物研发提供了潜在的靶点和理论基础。此外，该研究还强调了非催化区域在泛素连接酶组装泛素链过程中的重要作用，为未来研究泛素链组装机制指明了新的方向。
总的来说，这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为生命科学领域中泛素化修饰的研究增添了重要的一笔，为后续深入探究蛋白质降解机制以及相关疾病的病理过程提供了关键的理论支持，有望推动相关领域的进一步发展。
