基于配体依赖性结构动力学的通用蛋白质药理学检测平台开发及其在药物发现中的应用

本研究针对传统高通量筛选(HTS)技术面临的靶点依赖性高、检测方法复杂等瓶颈问题，开发了基于NanoLuc(NLuc)荧光素酶α互补系统的结构动力学响应(SDR)检测平台。研究人员通过将HiBiT/LgBiT报告系统与7类不同超家族蛋白融合，实现了非竞争性、功能非依赖性的配体结合检测，成功应用于化学文库筛选，可识别变构位点结合和辅因子诱导的协同效应。该技术突破了传统检测对高亲和力探针或功能输出的依赖，为难以研究的靶点提供了通用解决方案。

　　

在药物研发领域，如何高效检测蛋白质与配体的相互作用一直是制约新药发现的瓶颈。传统的高通量筛选方法往往受限于靶点特性：有的需要复杂的多酶偶联系统（如磷酸甘油酸变位酶iPGM检测），有的依赖不稳定的底物（如二氢叶酸还原酶DHFR需用易分解的二氢叶酸），还有的受制于高成本抗体或专用设备（如表面等离子共振SPR）。更棘手的是，针对不同蛋白家族需要开发完全不同的检测策略，这使得许多潜在靶点因缺乏合适检测方法而被搁置。

美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究，他们意外发现蛋白质末端融合的荧光报告系统能灵敏反映配体结合引起的构象变化，由此开发出名为结构动力学响应(SDR)的通用检测平台。该技术巧妙利用了NanoLuc荧光素酶的α互补特性——当11个氨基酸的HiBiT肽段与18kDa的LgBiT片段结合时，可重建完整酶活性。研究人员将HiBiT或完整NLuc与七类不同蛋白的N端或C端融合，证实配体结合引发的结构动态变化能显著改变报告信号。

关键技术包括：构建N/C端HiBiT或NLuc融合的靶蛋白表达系统；基于荧光素酶互补原理的配体结合检测；定量高通量筛选(qHTS)分析128-1343种化合物的浓度响应曲线；比较传统功能检测与SDR检测的敏感性差异；应用CRISPR/Cas9基因编辑构建内源性HiBiT标记细胞系。

在"Ligand binding couples to sensor protein output"部分，研究以萤火虫荧光素酶(FLuc)为模型，发现ATP依赖型抑制剂PTC124能通过SDR检测出两种结合状态：无ATP时pSDR₅₀=5.73，有ATP时提升至8.30。对1343种FLuc抑制剂的筛选揭示了化学型特异性反应，如吡唑并嘧啶类(clade P)化合物呈现ATP非依赖性结合，而芳基羧酸类(clade T)则严格依赖ATP存在。

"Generality of the SDR assay"部分展示了技术的普适性。在Abelson激酶(ABL1)研究中，SDR不仅检测到伊马替尼(imatinib)的ATP竞争性结合(pSDR₅₀=7.03 vs 功能检测pIC₅₀=5.60)，还能识别变构抑制剂asciminib（FDA批准的肉豆蔻酰口袋结合剂）。对于蛋白激酶A(PKA)，SDR对星形孢菌素(staurosporine)的检测灵敏度比传统方法高10倍(pSDR₅₀=7.71 vs pIC₅₀=6.67)。

研究团队在"Co-factor independent phosphoglycerate mutase"验证了SDR对难检测靶点的优势。使用仅20 pM的iPGM-C-HiBiT即可检测KD=38 pM的环肽抑制剂ipglycermide Ce-2，灵敏度比荧光偏振(FP)法高16倍。DNA连接酶研究则发现末端位置决定信号方向：E.coli连接酶N端HiBiT对NAD⁺响应强烈而C端无反应，反映辅因子结合引发的构象传递具有方向性。

在二氢叶酸还原酶(DHFR)研究中，SDR成功应用于内源蛋白检测。通过CRISPR编辑HEK293细胞使DHFR C端自带HiBiT标签，从细胞裂解液中直接检测到甲氨蝶呤(MTX)与NADPH的协同结合。与传统酶活检测相比，SDR对抗叶酸剂的敏感性提升100倍，如γ-氟甲氨蝶呤的pSDR₅₀达9.35。

讨论部分指出，SDR的独特优势在于：1)等温条件下直接检测配体结合，无需热变性步骤；2)信号增益型输出，与常规抑制型检测形成互补；3)可区分变构与正构结合；4)最低可检测0.2 nM内源蛋白。研究通过核磁共振结构分析揭示，DHFR与MTX结合时溶液构象簇的收缩可能是信号变化的 structural basis。虽然末端位置会影响检测灵敏度（如E.coli连接酶C端响应较弱），但通过优化标签位置可解决。

这项研究的意义在于建立了首个不依赖靶点功能的通用配体检测平台，使那些因检测方法缺失而被忽视的"undruggable"靶点重获研究可能。技术已应用于化学探针发现（如ABL1变构抑制剂）、药物协同效应研究（如ATP增强FLuc抑制剂结合）和病原体靶点验证（如线虫iPGM）。未来结合冷冻电镜等技术，有望进一步阐明配体诱导的构象变化与报告信号间的定量关系，为理性药物设计提供新维度。