阿江榄仁酸通过抑制Wnt3a介导的巨噬细胞M2极化抑制骨肉瘤进展的机制研究

本研究针对骨肉瘤(OS)高复发率与不良预后的临床难题，首次揭示传统中药Cyclocarya paliurus主要活性成分阿江榄仁酸(AA)通过靶向Wnt3a信号轴调控肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)极化，抑制M2型巨噬细胞分化并促进促炎性M1表型转化，从而显著抑制OS细胞增殖、迁移和侵袭。该发现为开发基于肿瘤微环境(TME)调控的新型OS治疗策略提供了重要药理学依据。

　　

骨肉瘤(OS)作为青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，尽管手术联合化疗使生存率有所提升，但高转移率和术后复发仍是临床面临的严峻挑战。肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞尤其是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在OS进展中扮演关键角色——促炎的M1型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，而M2型则促进肿瘤生长和转移。近年研究发现，调控巨噬细胞极化状态可能成为OS治疗的新突破口，但具体分子机制尚不明确。与此同时，传统中药青钱柳(Cyclocarya paliurus)中的三萜类成分阿江榄仁酸(Arjunolic acid, AA)虽被报道具有抗肿瘤潜力，其对OS的作用机制仍是未解之谜。

为破解这一科学问题，湖南中医药大学第一附属医院的研究团队通过体内外实验系统探究了AA对OS的抑制作用及其机制。研究首先建立OS裸鼠模型，发现AA处理显著减小肿瘤体积和重量，降低增殖标志物Ki67表达，同时增加癌细胞凋亡。体外实验证实，AA能选择性抑制OS细胞(Saos-2/U-2OS)活力而不影响正常成骨细胞hFOB 1.19。进一步通过Transwell共培养体系发现，AA预处理的M2型巨噬细胞可有效抑制OS细胞增殖、迁移并诱导细胞周期G1期阻滞。

机制研究揭示，AA通过双重调控巨噬细胞表型发挥作用：一方面促进M0巨噬细胞向M1型转化（CD86⁺、IL-6⁺），另一方面阻断OS细胞诱导的M2型极化（CD163⁺、Arg1⁺）。分子水平分析显示，AA特异性下调Wnt3a表达——该分子在M2型巨噬细胞中丰度最高。通过siRNA敲低和过表达实验证实，AA通过抑制Wnt3a介导的巨噬细胞M2极化，进而削弱OS细胞的恶性生物学行为。动物实验进一步验证，AA处理可重塑TME免疫格局，降低肿瘤组织Wnt3a水平，而Wnt3a基因干预能显著增强AA的抗OS效果。

该研究主要采用以下关键技术：建立皮下移植瘤裸鼠模型评估AA体内药效；通过EdU染色、流式细胞术和Transwell实验分析细胞增殖/凋亡/迁移；采用RT-qPCR和ELISA检测M1/M2标志物表达；利用基因沉默(siRNA)和过表达(oe-Wnt3a)技术验证靶点机制；结合免疫组化(IHC)和Western blot(WB)分析关键蛋白表达。

研究结果部分：

1. AA抑制OS小鼠肿瘤进展和转移：AA处理组肿瘤体积/重量下降40%，肺转移结节减少，伴随Ki67和细胞周期蛋白(CDK2/4、Cyclin D1)表达下调，凋亡率提升。
2. AA处理的巨噬细胞抑制OS恶性行为：50μg/mL AA使OS细胞增殖率降低60%，迁移细胞数减少2倍，同时延长G1期阻滞。
3. AA促进M1极化并阻断M2转化：AA使M0巨噬细胞CD86表达提升3倍，IL-6分泌增加2.5倍，同时抑制OS诱导的CD163和MMP-9表达。
4. AA靶向Wnt3a调控极化：Wnt3a在M2型表达量是M1型的5倍，AA处理使其降低50%；si-Wnt3a可协同增强AA的M2抑制效应。
5. Wnt3a干预增强AA疗效：敲低Wnt3a使小鼠肿瘤体积进一步缩小35%，而过表达则逆转AA的抗肿瘤作用。

结论与讨论：
该研究首次阐明AA通过靶向Wnt3a-巨噬细胞极化轴抑制OS进展的双重机制：既阻断促瘤性M2型分化，又激活抗肿瘤M1型转化。这一发现不仅为青钱柳的药用价值提供科学依据，更开创了通过调控TME免疫格局治疗OS的新思路。值得注意的是，AA对正常细胞低毒性的特点（100μg/mL才影响hFOB活力）显示出良好的临床转化潜力。未来研究可进一步优化AA给药方案，并探索其与其他免疫疗法的协同效应。论文发表于《Genes》杂志，为开发基于天然产物的OS靶向治疗策略奠定了重要理论基础。